可用于尿酸检测的钯纳米粒子的制备及初步应用*

邹瑟音，周 念，黄文秀，凌连生，曹东林，雷 达

(1.广东省第二人民医院检验医学部，广东广州 518037；2.中山大学化学与工程学院，广东广州 510275)

过氧化物酶是一类以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的氧化还原酶，它们能催化很多反应，大部分的过氧化物酶都由植物、真菌或细菌产生，如辣根过氧化物酶(HRP)、木质素过氧化物酶、酵母细胞色素C过氧化物酶等[1-5]，它们被广泛应用于临床检验项目的检测，是试剂盒显色体系中的关键成分。然而，天然过氧化物酶属于蛋白，在实际应用中也存在许多不足，随着纳米医学技术的不断发展，越来越多的研究者致力于寻找或设计出可替代天然过氧化物酶的材料，如纳米模拟酶，指模拟具有天然过氧化物酶的特定催化活性的纳米材料，它们既具备天然过氧化物酶的优良催化活性，又弥补了天然过氧化物酶的各种不足，可应用于各种物质的检测。AMOURIZI等[6]通过化学还原法合成具有过氧化物酶活性的金纳米粒子PVA-GNPs，可通过比色法进行氟离子(F-)、溴离子(Br-) 和碘离子(I-) 等负离子的检测。WU等[7]通过简单而高效的方法合成的氧化亚铜(Cu2O)纳米粒子表现出极高的类过氧化物酶活性，可应用于检测葡萄糖和胆固醇。SHI等[8]的研究利用二价铜离子和氮掺杂石墨烯量子点，在碱性条件下合成的纳米复合材料展现出来的类过氧化物酶活性远高于纯Cu2O 纳米粒子和天然过氧化物酶POx，且该研究基于尿酸酶建立了一种用于微量尿酸检测的化学发光法。本研究自行设计合成具有氢键超分子结构的钯纳米粒子复合物(MCA-Pd NPs)，并应用到尿酸检测中，以初步探讨其对临床血清标本中尿酸进行检测的可行性。

1 材料与方法

1.1标本来源 5份血清标本均来自广东省第二人民医院门诊及住院患者，3 000 r/min离心5 min，2 h内检测。

1.2仪器与试剂 30%过氧化氢(H2O2)溶液购自国药集团化学试剂有限公司；三聚氰胺(C3N6H6)、三聚氰酸(C3H3N3O3)购自比利时Acros Organics公司，无水柠檬酸(C6H8O7)、无水乙酸钠(CH3COONa)、醋酸(CH3COOH)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；氯化钯(PdCl2)、2，2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻挫啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS2-)购自上海生工生物工程有限公司；浓盐酸购自广州化学试剂厂；尿酸标准品购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；HRP购自Sigma公司；尿酸酶购自上海瓦兰生物科技有限公司；试验过程中所用的水皆为超纯水，且所用试剂均为分析纯。UV-2550 紫外-可见分光光度计购自日本岛津公司；GZX-9146数显鼓风干燥箱购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Optima MAX-XP台式超速离心机购自美国Beckman Coulter公司； B-260恒温水浴锅购自上海亚荣生化仪器厂；85-2型恒温磁力搅拌器购自巩义市予华仪器有限责任公司；电子天秤购自赛多利斯科学仪器有限公司；日立7600生化分析仪及配套试剂购自北京利德曼生化股份有限公司。

1.3方法

1.3.1MCA-Pd NPs的合成 在洗净、烘干的150 mL的烧杯中加入10 mL的C3N6H6溶液，不断搅拌情况下，同时再将0.4 mL的50 mmol/L H2PdCl4加入上述C3N6H6溶液中；然后，将10 mL的10 mmol/L C3H3N3O3加入上述混合液中；最后，在混合液中加入0.8 mL的50 mmol/L C6H8O7。可以观察到混合液中开始出现黄色沉淀物，在室温下持续搅拌12 h后，即可合成具有氢键超分子结构的MCA-Pd NPs，可以用于后续试验。

1.3.2比色分析 所有标本的比色分析均使用UV-2550紫外-可见分光光度计完成，每一批检测都同时设置空白管作为参比溶液，在参比池和测试池中同时放置参比溶液对仪器进行基线校正，然后依次将样品放入测试池中进行检测，记录吸光度值。

1.3.3尿酸标准曲线制备 准确称取适量的尿酸标准品，用超纯水溶解并定容至刻度，充分摇匀，此溶液为5 mmol/L尿酸标准储备液，于 4 ℃保存；临用前，将尿酸标准储备液用超纯水稀释至1 mmol/L，此为尿酸标准应用液。分别用超纯水稀释配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的尿酸标准系列溶液。进行比色分析，每个水平重复测定3次，取吸光度值的均值为纵坐标，以尿酸水平(μmol/L)为横坐标，绘制尿酸标准曲线，并计算回归方程。

1.3.4临床标本检测 5份临床血清标本分别用本试验建立的尿酸检测体系和日立7600生化分析仪进行尿酸水平检测，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.5MCA-Pd NPs的稳定性检测 新合成的MCA-Pd NPs放置于室温，用反应体系20 μL 1 mmol/L H2O2+100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL ABTS2-，每隔5 d检测一次酶活性，比色法检测吸光度值越高说明酶活性越强，连续检测6次共30 d。

1.3.6尿酸检测体系的建立 参考常用于尿酸检测的尿酸酶-过氧化物酶偶联法，为了检测MCA-Pd NPs在尿酸检测体系中发挥过氧化物酶的催化作用，应用HRP作为参照在室温条件下设计了如下试验：(1)a管，10 μL 蒸馏水+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+100 μL 2 000 U/L HRP+50 μL 90 mmol/L ABTS2-；(2)b管，10 μL 310 μmol/L 尿酸+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+100 μL 2 000 U/L HRP+50 μL 90 mmol/L ABTS2-；(3)c管，10 μL 310 μmol/L 尿酸+50 μL 1.6 g/L 尿酸酶+100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL 90 mmol/L ABTS2-；(4)d管，50 μL 蒸馏水+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL 90 mmol/L ABTS2-。

1.3.7尿酸检测体系条件优化 (1)MCA-Pd NPs和ABTS2-用量的确定，为保证反应体系中MCA-Pd NPs和ABTS2-足量，但同时不能浪费材料，先同时固定H2O2溶液(1 mmol/L)和ABTS2-(90 mmol/L)的用量分别为20 μL和80 μL，各反应管加入不同体积的MCA-Pd NPs(20、40、80、160、250 μL)，在420 nm波长处检测吸光度值；接着固定H2O2溶液(1 mmol/L)和MCA-Pd NPs(0.105 mg/mL)，用量分别为20 μL 和100 μL，各反应管加入不同体积的ABTS2-(10、20、40、80、120 μL)，在420 nm波长处检测吸光度值。(2)反应温度和时间的确定，为确定最佳反应温度设计如下试验：4管混合液(10 μL 310 μmol/L尿酸标准品+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL 90 mmol/L ABTS2-)分别在室温25 ℃、水浴锅37 ℃、水浴锅42 ℃、水浴锅50 ℃反应30 min，对它们在420 nm下的吸光度值进行测定分析。通过设计以下试验来确定体系的最佳反应时间：10 μL 300 μmol/L尿酸标准应用液+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+ 100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL ABTS2-，共5管反应管混匀，于37 ℃分别反应5、10、20、30、40 min，对它们在420 nm处的吸光度值进行测定分析。

1.3.8临床标本检测 参考尿酸临床检测范围，选取6个工作标准液点建立标准曲线；在最佳反应条件下检测5份临床血清标本，并与临床日立7600生化分析仪检测结果进行比较，检测严格按试剂盒说明书操作。

1.4统计学处理 采用Microsoft Excel2003和 SSPS17.0统计软件进行数据处理和统计学分析，不同方法检测的结果比较采用配对样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1过氧化物模拟酶活性检测结果 a管液体在420 nm处有明显的特征吸收峰，而b管和c管液体在420 nm处几乎没有吸收，与肉眼观察结果相符，只有当ABTS2-、MCA-Pd NPs和H2O2同时存在时，才能将无色的ABTS2-变为绿色自由基ABTS-，而在420 nm处有特征吸收峰。

2.2MCA-Pd NPs的稳定性检测结果 到第30天时吸光度值仍为2.11，与第1天检测的吸光度值2.185差别微小。

2.3尿酸检测体系的建立情况 肉眼可见b和c两管液体由无色转变为绿色，而a和d两管液体仍表现为无色，使用紫外-可见分光光度计在420 nm波长处分别对4管混合液进行吸光度值检测，b和c两管液体均有较高的吸光度值，而a、c两管液体在420 nm处几乎没有吸收，与肉眼观察结果相符，见图1，MCA-Pd NPs具有与HRP相似的过氧化物酶活性，能应用到尿酸检测体系中。

注：a为蒸馏水+尿酸酶+HRP+ABTS2-；b为尿酸+尿酸酶+ HRP+ABTS2-；c为尿酸+尿酸酶+MCA-Pd NPs+ABTS2-；d为蒸馏水+尿酸酶+MCA-Pd NPs+ABTS2-。图1 尿酸检测体系中不同试验管的吸光度值

2.4尿酸检测体系条件的优化情况 (1)MCA-Pd NPs和ABTS2-用量，检测发现MCA-Pd NPs和ABTS2-用量分别为80 μL和40 μL时吸光度值即达到最高值，后面随着用量增加，吸光度值没有增加。在该检测体系中20 μL 1 mmol/L H2O2要被完全催化还原并表现为溶液颜色的改变，需要MCA-Pd NPs体积>80 μL、ABTS2-体积>40 μL，因此，在后面的检测体系中将MCA-Pd NPs(0.105 mg/mL)和ABTS2-(90 mmol/L)用量分别固定为100 μL和50 μL。(2)最佳反应温度，在25～37 ℃时，反应体系随着温度升高而吸光度值增强，在37～50 ℃时，吸光度值随着温度升高而减弱，MCA-Pd NPs及尿酸酶的酶活性在37 ℃达到最优，选择37 ℃为体系的最佳反应温度。(3)最佳反应时间，反应体系随着温育时间延长而吸光度值增强，在达到20 min以后，吸光度值随着时间的延长而升高不明显，为了缩短反应时间，使检测体系更具有实用性，选择20 min这个时间点为体系的最优温育时间。见图2。

图2 检测体系在不同时间点的吸光度值变化

2.5临床血清标本检测结果 临床血清标本检测结果与临床常用生化分析仪检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，临床诊断为痛风的2例患者(标本4和标本5)血清尿酸水平均明显升高，见表1，该检测体系初步应用于检测临床血液标本是可行的。

表1 两种检测方法检测血清中尿酸的水平(μmol/L)

3 讨 论

纳米材料具有表面效应、量子尺寸效应、体积效应及宏观量子隧道效应等优越性能，在尺寸、形状和表面电荷等方面与天然过氧化物酶具有一定的相似性，许多纳米材料如四氧化三铁磁性纳米粒子(Fe3O4MNPs)、贵金属纳米粒子、碳基纳米材料等被发现具有过氧化物酶活性，并被应用到生物传感、免疫分析、癌症诊断与治疗、神经保护、环境治理等领域[9-11]。本研究自行设计合成的MCA-Pd NPs通过化学反应将钯纳米粒子固定在C3N6H6和C3H3N3O3形成的氢键超分子骨架上(MCA)，MCA本身不具备内在的过氧化物催化活性，但是由于MCA的氢键超分子结构，使它在促进纳米粒子的催化活性上起到了关键的作用[12-13]，MCA上面的活性位点使微小颗粒的钯纳米粒子吸附稳定，并避免了钯纳米粒子的聚集，同时氢键超分子结构为微小颗粒的钯纳米粒子提供了模拟酶骨架，因而具有非常强而稳定的类过氧化物酶催化活性，能催化H2O2产生某种中间物质，从而进一步氧化ABTS2-至ABTS-，使溶液颜色由无色转变成绿色，见图1，与文献[14-16]报道的具有过氧化物模拟酶活性的纳米材料能促进过氧化氢分解产生具有强氧化性的羟基自由基而氧化底物的说法相一致。

过氧化物酶作为临床检验试剂中的常用酶，被广泛应用于各种临床检测方法中，但是由于天然过氧化物酶具有性质不稳定，在生物体的水平较低，提纯及储存较困难，在过酸、过碱及高温条件下容易失活等缺点，导致天然过氧化物酶的使用条件变得苛刻，因此限制了它的实际应用[17-19]。而纳米材料模拟酶能够模拟天然过氧化物酶的活性，并弥补了天然过氧化物酶的许多不足，具有制备简单，制造及储存成本低，容易大规模生产和保存运输，对外界环境耐受性强，性质比较稳定，不易失活等优点。而本试验设计合成的MCA-Pd NPs具备制作简单，易于保存，稳定性好，过氧化物酶活性高等与以上所述优点相符合的特性。为进一步证明MCA-Pd NPs酶活性的实用性，将其应用到基于尿酸酶的比色法尿酸检测体系中，考虑到检测体系会受到反应物用量、反应温度及温育时间等因素的影响，通过设计一系列的试验来寻找到该检测体系的最优反应条件，并在最优反应条件下进行血清标本的检测，检测结果与临床诊断相符合，为下一步扩大标本量的临床试验奠定了坚实可靠的试验基础。

目前，临床上常用于血清尿酸检测的方法主要是尿酸酶-过氧化物酶耦联法[20-22]。本试验将自行设计合成的具有类过氧化物酶活性的MCA-Pd NPs取代天然过氧化物酶应用到尿酸检测体系中，对该体系进行了改进，只需要加入一种底物ABTS2-来替代常规方法中的3,5-二氯-2-羟苯磺酸(DHBS)和4-氨基安替比林(4-AAP)，就能对血清中的尿酸水平进行定量检测，使检测体系简单化，同时减少影响因素，降低试剂成本，具有实际意义。此外，临床中的许多常规检验项目，如尿酸、血糖、5′-核苷酶、总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇等物质的检测原理都涉及过氧化物酶，若能将本课题组自行合成的MCA-Pd NPs应用到实际的临床实验室检测工作中，具有非常重要而广泛的实用价值。

4 结 论

本研究通过简单的一步法合成了性质稳定、类过氧化物酶活性强的MCA-Pd NPs，一系列的试验研究证明了MCA-Pd NPs具有与HRP相当的强而稳定的酶活性，并由此建立一种可初步应用于临床血清标本尿酸检测的比色法。