3种实时荧光PCR仪对120份新型冠状病毒检测标本的检测结果比较*

黄玉兰，韩声付，曾林子，肯 布，张光慧，贾春燕，彭秀娟，杨小蓉△

(1.四川省疾病预防控制中心，四川成都 610041；2.炉霍县疾病预防控制中心，四川甘孜 626500；3.绵阳市第三人民医院/四川省精神卫生中心检验科,四川绵阳 621000)

新型冠状病毒属于冠状病毒科β属，包括29 891个核苷酸，并编码9 860个氨基酸，与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)同源性为82%[1]，其传染性强于SARS-CoV[2-3]。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测新型冠状病毒核酸阳性为确诊病例的病原学金标准之一[4]。实时荧光PCR技术具有结果直观，重复性好、特异性强、灵敏度高和易操作等优点[5]。然而，核酸检测的准确性也会受标本质量、运输、储存条件、核酸检测试剂性能及PCR仪等因素影响[6]。为了解实时荧光PCR仪对核酸检测结果的影响，本研究拟对同一批标本使用同一厂家、同一批号新型冠状病毒核酸检测试剂，在3种不同厂家生产的实时荧光PCR仪上进行平行检测，并对检测结果进行比较分析，供仪器厂家和检测机构参考。

1 材料与方法

1.1标本来源 120份咽拭子、尿液、粪便及唾液标本采集自120例有临床症状的新型冠状病毒肺炎患者及其密切接触者，其中咽拭子标本81份，尿液标本14份，唾液标本14份，粪便标本11份。所有标本采集及运输均符合《新型冠状病毒实验室检测技术指南(第五版)》[7]要求。

1.2仪器与试剂 全自动核酸提取仪NatchS(圣湘生物科技股份有限公司，长沙)；本试验选取国内外3个厂家(编号为A、B、C)生产的不同型号实时荧光PCR仪对标本进行检测。病毒标本采集保存液(梓健生物科技有限公司，深圳，批号:2020013001)；新型冠状病毒核酸提取试剂盒(圣湘生物科技股份有限公司，长沙，批号2019002、2020004)，靶基因位点为开放读取框(ORF)1ab和核壳蛋白(N)基因，其检出限为200 copy/mL；TRIzol®Reagent试剂(Ambion公司,美国，批号:15596026)。

1.3方法 试验操作均按照《新型冠状病毒PCR实验室生物安全要求(第二版)》[8]。所有标本预先放置到56 ℃恒温培养箱中，进行30 min灭活处理。

1.3.1标本前处理 (1)粪便标本:用棉签挑取黄豆粒大小粪便标本至50 mL无菌离心管中，加入2 mL TRIzol®Reagent，混合均匀，静置10 min后吸取600 μL上清液至1.5 mL离心管，5 000 r/min离心5 min，吸取上清液待用。(2)唾液标本:加入400 μL病毒保存液混合均匀后待用。(3)咽拭子标本:混合均匀后待用。

1.3.2核酸提取 分别吸取200 μL前处理标本，采用全自动核酸提取仪NatchS及核酸提取试剂盒(圣湘生物科技股份有限公司，长沙)，按照说明书步骤进行核酸提取。

1.3.3核酸扩增 按照新型冠状病毒核酸检测试剂说明书配制反应体系，分别采用A、B、C 3种实时荧光PCR仪，按照说明书设置反应程序，对120份标本进行检测，并对结果进行判定，若ORF1ab及N基因Ct值均<40，结果判为阳性；若仅有单个基因Ct值<40，结果判为单基因阳性；若ORF1ab及N基因Ct值均>40，结果判为阴性。

1.3.4质量控制 每批次试验均带有阴、阳性对照及内标，阴、阳性结果符合，且内标Ct值<40，则该批次检测结果有效，反之需重复试验。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行数据处理及统计分析，计数资料以例数或百分率表示，3种检测结果比较采用配对χ2检验。通过计算Kappa值，分析检测结果一致性:K≥0.75一致性好，0.40≤K<0.75一致性一般，K<0.40一致性差。

2 结 果

2.13种仪器基本情况 3种仪器生产日期、温控方式、光源等存在差异，仪器基本情况比较见表1。

表1 3种仪器基本情况比较

2.23种仪器检测结果 仪器A检出阳性51例，阴性40例，单基因阳性29例(均为N基因阳性)，检出率为42.50%(51/120)。仪器B检出阳性42例，阴性54例，单基因阳性24例(1例ORF1ab基因阳性，其余N基因阳性)，检出率为35.00%(42/120)。仪器C检出阳性46例，阴性49例，单基因阳性25例(均为N基因阳性)，检出率为38.33%(46/120)。

2.33种仪器检测结果一致性 120例患者标本，有95例通过3种仪器扩增后检测结果一致，其中阳性41例，阴性40例，单基因阳性14例，25例检测结果不一致，见表2。由于研究使用的新型冠状病毒核酸检测试剂盒说明书申明适用仪器为A，因此，将仪器A检测结果作为参照进行比较，仪器B扩增后有99例与仪器A结果一致，其中阳性42例，阴性40例，单基因阳性17例；仪器C扩增后有106例与仪器A结果一致，其中阳性46例，阴性40例，单基因阳性20例。

表2 3种仪器检测结果差异

2.4仪器A与仪器B检测结果一致性比较 120例标本运用仪器A及仪器B扩增后，仪器A检出阳性标本51例，仪器B与仪器A一致的有42例，仪器B将其中8例检测为单基因阳性(1例ORF1ab阳性，7例N基因阳性)，1例检测为阴性；进行χ2检验，仪器A和仪器B检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，两种仪器检测结果间一致性一般(K=0.732)， 检测结果一致性见表3。

表3 仪器A及仪器B扩增检测结果一致性比较(n)

2.5仪器A与仪器C检测结果一致性比较 120例患者标本采用仪器A及仪器C扩增后，仪器A检出阳性51例，仪器C与仪器A一致的有46例，仪器C将其中5例检测为单基因阳性(均为N基因阳性)；进行χ2检验，仪器A和仪器C检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，两种仪器检测结果间一致性好(K=0.821)，检测结果一致性见表4。

表4 仪器A及仪器C扩增检测结果一致性比较(n)

3 讨 论

本研究采用的标本类型为新型冠状病毒肺炎确诊患者及密切接触者的咽拭子、粪便、尿液和唾液标本，3种仪器均适合对不同标本提取的核酸进行检测。本试验采用的核酸检测试剂盒说明书上标示适用仪器为仪器A，本研究仅针对各仪器相应型号进行比较。

2020年1月9日，我国科研人员通过测序成功破译出新型冠状病毒全基因组序列，并提交在virologic.org网站和GenBank。随后市面上各种检测新型冠状病毒的商品化试剂盒相继面世，其中PCR方法由于其灵敏度高、特异性强，目前已成为检测新型冠状病毒核酸的主要方法[9]。检测靶标主要有ORF1ab、N基因及包膜蛋白(E)基因上的特异性保守序列，也有少数商品试剂盒同时检测刺突糖蛋白(S)基因，实验室针对新型冠状病毒的核酸检测应至少包含最为保守及特异的ORF1ab及N基因[10-12]。内源性检测系统(内标，IC)主要用于对标本采集、核酸提取及扩增过程进行监控，避免外部因素造成假阴性结果[13-15]。本研究所用的新型冠状病毒核酸检测试剂检测目的基因为ORF1ab及N基因，同时含有内源性检测系统，其最低检出限为200 copy/mL，尽可能避免由于试剂灵敏度等原因对仪器检出结果造成影响。

温控模块、荧光激发是实时荧光PCR仪的关键装置，不同品牌仪器的温控模块及荧光激发系统有所不同。如果实时荧光PCR仪与试剂的匹配性不好，就可能会影响到检测结果。本研究中所用试剂说明书指明最适仪器为仪器A，与之检测结果相比，运用仪器B检测结果一致性一般，运用仪器C检测结果一致性好。因此，在实际工作中，如果实验室没有配置与检测试剂盒匹配的实时荧光PCR仪，那么应运用多种质控手段确保检测结果的准确性。

从软件操作及结果分析来比较，仪器A和仪器B为中文操作界面，适应人群更广，特别是对基层人员更容易操作，便于分析。而仪器C的全英文操作界面对操作人员英文水平有一定要求，且在结果分析时，与前两者相比不能同时选择3个通道查看结果，操作上较为复杂。值得注意的是，由于本研究试剂盒选择FAM(ORF1ab)、ROX(N基因)、HEX(内标)通道进行检测，分别对应波长为470～510、580～620、530～565 nm，而仪器C仅有与HEX通道波长相近的VIC通道，其波长为533～580 nm，因此与测定N基因的ROX通道波长有交叉，影响结果判定，因此，需要通过颜色补偿校准ROX和HEX通道，修正内标和N基因之间的干扰。

实时荧光PCR仪是精密复杂的仪器，电子元件的性能也会随着使用年限增加而逐渐老化，影响检测结果。本研究中使用的仪器C为2012年购置，未进行定期校正，可能影响结果的准确性。因此，定期对实时荧光PCR仪进行校正非常必要。

4 结 论

通过对不同型号实时荧光PCR仪检测新型冠状病毒肺炎标本结果比较分析，3种仪器检测结果和检测一致性存在一定差异，提示厂家需进一步优化仪器性能，同时各检测机构应按照要求对实时荧光PCR仪进行校准维护，确保检测结果准确性。