铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-PopB的构建、鉴定及其在大肠埃希菌中的表达效率*

何爱琳，李文桂，梁诚诚

(重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所，重庆 400016)

铜绿假单胞菌(Pa)是一种机会性病原体，在人体可引起多种疾病。该菌常与院内感染有关，尤其在免疫功能低下的患者中易致病，常引起肺炎、尿路感染和菌血症等[1]。Pa具备明显的抗菌能力，可通过其内在和获得性的耐药机制来对抗大多数抗菌药物，造成多重耐药株和完全耐药株的产生，对免疫受损者和住院患者构成严重威胁[2-3]。有学者对2006—2016年临床分离的Pa菌株进行调查分析，结果显示多重耐药Pa感染的患者其病死率高达44.6 %，是导致患者死亡的最大风险因素之一[4]。若Pa感染未及时控制，将给临床治疗带来极大的挑战。现有对抗Pa感染的新疗法包括注射疫苗，使用噬菌体、益生菌、抗菌肽及毒力抑制剂等[5]，其中疫苗可有效减少特定病原体的数量，从而改善抗菌药物耐药性，是防治Pa感染的重要手段之一[6]。膜蛋白PopB是Ⅲ型分泌系统(T3SS)转运蛋白的组成成分之一，利用该系统能将效应蛋白注入真核细胞内，从而抑制宿主细胞的免疫功能，引发感染[7-8]。RAO等[9]用PopB蛋白可诱导Pa感染的囊性纤维化患者产生体液免疫反应，提示其具有抗原性，是一种新型的治疗Pa感染候选疫苗分子。本研究拟将PopB基因插入表达载体pGEX-1λT，构建pGEX-PopB，并研究该重组质粒在大肠埃希菌的表达效率，从而为Pa疫苗的研制提供有价值的资料。

1 材料与方法

1.1质粒、菌株和宿主菌 pGEX-1λT、Pa的PA01标准株和大肠埃希菌BL21(DE3)由本所保存。

1.2主要试剂 UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒、UNIQ-1柱式PCR产物纯化试剂盒、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒、高效感受态细胞制备试剂盒、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂及考马斯亮蓝试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4 DNA连接酶和DNA标记物购自美国 Fermentas公司；LB液体和固体培养基由本所制备；中相对分子质量蛋白购自北京鼎国昌盛生物技术公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自北京鼎今生物科技有限公司；Pa感染的鼠血清由本所保存。

1.3方法

1.3.1PopB基因的扩增及鉴定 根据PopB基因的DNA序列和载体pGEX-1λT的特点设计1对引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。P1(上游引物)：5′-GCGGATTC-TTT GGA TCC ATG AAT CCG ATA ACG CTT G-3′；P2(下游引物)：5′-GCGAATTC-TTT GAA TTC TCA GAT CGC TGC CGG TCG-3′。5′端处分别引入BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点。按照细菌基因组抽提试剂盒的说明书抽提Pa DNA。以提取的DNA为模板，P1和P2为引物，PCR扩增PopB基因。扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环，最后72 ℃再次延伸10 min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.3.2重组质粒pGEX-PopB的构建及鉴定 将PopB的扩增产物和载体pGEX-1λT用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，并按照纯化试剂盒说明书对酶切产物进行纯化。酶切体系共60 μL：42.0 μL的PCR产物或载体，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ各1.3 μL，6.0 μL的10×Tango缓冲液，9.4 μL的灭菌去离子水。置37 ℃水浴2 h；将载体和PopB基因片段按比例约1∶5混合，并在T4 DNA连接酶作用下建立连接体系，共20 μL：13 μL的载体片段，3 μL的PopB基因片段，T4 DNA连接酶和10×T4 Buffer各2 μL。置4 ℃连接过夜后70 ℃水浴10 min；将连接产物电穿孔转化至大肠埃希菌感受态BL21(DE3)，37 ℃ 150 r/min振摇培养1 h后接种于含氨苄西林(50 μg/mL)的溶菌肉汤(LB)固体培养基上进行筛选。在培养基中挑取单菌落后加入同上述浓度氨苄西林的LB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min振摇培养72 h后抽提质粒，按上述酶切体系双酶切，并以提取的质粒为模板，按上述PCR条件扩增PopB基因。分别对酶切产物和PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.3pGEX-PopB在大肠埃希菌BL21(DE3)中的诱导表达、分析及鉴定 将含有重组质粒pGEX-PopB的菌液振摇培养至600 nm波长处吸光度值为0.5～0.8，取适量作为未诱导对照，剩余菌液加入IPTG(1 mmol/L)，37 ℃诱导表达，分别在1、3、5、7、9、11、13 h收集菌液，5 000 r/min离心2 mim，弃上清液，分别吸取50 μL的上样缓冲液和20 μL的菌液，将其混合后煮沸5 min，吸取20 μL样品经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝试剂染色后脱色至凝胶透明、条带清晰，BIO-RAD凝胶成像仪分析重组蛋白表达量。SDS-PAGE电泳后，切下蛋白标记物，考马斯亮蓝试剂染色约1 h后脱色，余下凝胶150 mA恒流电转膜2 h，取出NC膜，封闭液封闭2 h，PBS漂洗3次；加入一抗(1∶100稀释的Pa感染鼠血清)，室温转摇封闭2 h，PBS漂洗3次；加入二抗(1∶1 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG)，室温孵育2 h，PBS漂洗3次；加入新配制的DAB显色剂避光反应10～15 min，用双蒸水洗膜终止反应并成像。

2 结 果

2.1PopB基因的鉴定 以PA01标准株的DNA为模板，扩增获得1 200 bp的PopB基因片段，见图1。

注：M为DNA 标记物；1～7为PopB基因的PCR产物。图1 PopB基因PCR扩增产物鉴定

2.2重组质粒pGEX-PopB的酶切鉴定 重组质粒用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切分别获得4 947 bp的pGEX-1λT载体片段和1 200 bp的PopB基因片段，见图2。

注：M为DNA 标记物；1、2为pGEX-1λT；3、4为重组质粒pGEX-PopB双酶切产物。图2 pGEX-PopB的双酶切鉴定

2.3重组质粒pGEX-PopB的PCR鉴定 从具有氨苄西林抗性的重组菌中提取质粒，并以该质粒为模板经PCR扩增可获得1 200 bp的PopB基因片段，见图3。

注：M为DNA 标记物；1～4为重组质粒pGEX-PopB的PCR产物。图3 重组质粒pGEX-PopB的PCR扩增产物鉴定

2.4重组质粒pGEX-PopB在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达产物的SDS-PAGE分析 重组质粒pGEX-PopB转化大肠埃希菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳结果显示其蛋白表达量约为66×103。BIO-RAD凝胶成像仪提示PopB融合蛋白占全菌总量的20%，在IPTG诱导3～5 h时其表达量较高，而未诱导的转化菌无此条带，见图4。

注：M为中相对分子质量蛋白标记物；1为未诱导的重组菌；2～8为分别经IPTG诱导1、3、5、7、9、11、13 h的重组菌。图4 重组菌pGEX-PopB表达产物的SDS-PAGE分析

2.5Western blot鉴定 将大肠埃希菌表达的PopB蛋白与Pa感染的鼠血清做Western blot，在相对分子质量为66×103M处有一特异性反应条带，而非诱导的重组菌无此条带，见图5。

注：M为中相对分子质量蛋白标记物；1为未诱导对照组；2为PopB蛋白与Pa感染鼠血清反应Western blot结果。图5 重组菌pGEX-PopB表达产物的Western blot鉴定

3 讨 论

PopB蛋白是T3SS中高度保守的成分之一，也是公认的毒力因子之一[10]。研究证实，用纯化的重组PopB蛋白免疫小鼠能诱导IgG特异性抗体的产生，并且对致命的Pa感染可产生明显的保护作用，表明PopB具有免疫原性，是极具研究价值的疫苗分子之一[11]。WU等[12]以PA01株基因组为模板，通过PCR扩增PopB基因，克隆至载体pET-28b构建重组质粒，并转化大肠埃希菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达约40×103的重组His-PopB蛋白，用该蛋白免疫小鼠可诱导其产生抗Pa感染的保护力。本研究以PA01株DNA为模板，PCR扩增获得1 200 bp的PopB基因片段，构建了pGEX-PopB重组质粒，为研究载体pGEX-1λT表达的融合蛋白打下了基础。

大肠埃希菌表达系统是当前常用的外源蛋白表达系统。BL21具有易于培养、遗传背景明确、成本低、生长速度快及可表达各种外源基因等优点，是生产重组蛋白常用的表达菌株之一。pGEX载体可用于构建高水平表达的目的基因片段，其中pGEX-1λT是以大肠埃希菌为宿主，并且能高效表达融合蛋白的载体之一。pGEX-1λT多克隆位点的上游包含有表达26×103蛋白的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因片段。GST能提高外源蛋白稳定性和可溶性，同时又保留蛋白的抗原性和生物活性。带有GST标签的融合蛋白能通过特定的目的基因插入pGEX-1λT的多克隆位点，其上含有laclq基因，该基因的表达产物可作为抑制剂结合在tac启动子的操纵子区，加入诱导剂IPTG后，目的基因能在tac启动子的调控下高效表达目的蛋白。刘潇等[13]将OprI基因插入pGEX-1λT，构建重组质粒pGEX-OprI，再将该质粒导入BL21中可成功表达Pa的目的蛋白。

本研究采用的电穿孔技术是分子生物学中质粒DNA转化大肠埃希菌常用的方法之一。该技术由于操作简单快捷，转化效率高，已广泛应用于原核细胞外源生物分子的导入。用于电穿孔的BL21感受态是由37 ℃培养的细菌所制备，转化效率达108～109cfu/μg DNA。通过EP技术可诱导Ⅰ型干扰素的分泌，促炎性细胞因子的产生，如白细胞介素(IL)-1β、IL-8和IL-17等，同时可增加转化生长因子水平，提高自然杀伤细胞、抗原呈递细胞和巨噬细胞的募集，起到类似于佐剂的作用，从而增强免疫效应。EP可明显提高基于质粒DNA编码的免疫原性蛋白的表达，在疫苗或基因治疗领域具有广阔的应用前景。已报道电穿孔技术辅助的DNA疫苗在登革热、艾滋病和埃博拉病毒病等动物模型中诱导了理想的保护性免疫反应[14-16]。

4 结 论

本研究在成功构建重组质粒pGEX-PopB基础上，采用电穿孔转化至大肠埃希菌感受态BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达与预期结果相符的融合蛋白，该融合蛋白占菌体总量的20 %，且在诱导3～5 h时表达量达较高水平。Western blot证实该融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特异识别，表明重组蛋白具有一定的免疫原性，为Pa疫苗的进一步研制奠定了良好的基础。