ALDH2基因rs671单核苷酸多态性位点发生(A→G)RNA编辑*

夏万松，夏 英,2，韦四喜，周春欢，杜 洪，袁 婷，金 泳，黄 海△

(1.贵州医科大学医学检验学院，贵州贵阳 550004；2.贵州中医药大学第一附属医院检验科，贵州贵阳 550001；3.贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州贵阳 550004；4.贵航贵阳医院检验科，贵州贵阳 550009)

乙醛脱氢酶2(ALDH2)rs671单核苷酸多态性(SNP)被鉴定为活性纯合ALDH2 rs671(GG)、非活性杂合ALDH2 rs671(GA)、非活性纯合ALDH2 rs671(AA)[1]。ALDH2 rs671SNP存在于世界近十分之一人口中，是人类最常见的变异，约5.4亿人携带ALDH2 rs671SNP[2]。携带ALDH2 rs671SNP的个体饮酒后会出现酒精代谢障碍的表现，如面部潮红和心率增加[3-4]。重要的是ALDH2 rs671SNP除了会引起酒精反应外，还能影响某些药物的代谢，危及携带者的健康。ALDH2 rs671SNP可增加胃癌、食管癌、上呼吸道鳞状细胞癌的患病风险[5-9]。此外，ALDH2 rs671SNP与多种非癌症疾病相关，是心肌梗死[10-11]、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的危险因素[12]。ALDH2 rs671SNP也可以明显增加髋部骨折风险[13]。然而，目前的研究较为局限，仅在DNA水平研究个体的ALDH2 rs671SNP与疾病的相关性，关于携带ALDH2 rs671SNP的个体ALDH2基因在信使RNA(mRNA)水平的改变研究尚比较少见。因此，本研究探讨了ALDH2 rs671SNP的个体ALDH2基因在mRNA水平的改变，为进一步揭示ALDH2 rs671SNP影响人类健康的机制提供基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 将贵州医科大学附属医院体检中心的48例体检者作为研究对象，收集所有研究对象外周抗凝全血标本，其中男24例，女24例；年龄20～40岁。本研究经贵州医科大学附属医院医学伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 红细胞裂解液购于北京索莱宝科技有限公司，DNA及总RNA提取试剂盒、TRIZOL reagent、DNA纯化试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司，实验所需引物合成及聚合酶链反应(PCR)产物测序也由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，反转录试剂盒购于TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶购于美国Vazyme Biotech公司。ABI Pro FlexTM梯度PCR扩增仪购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，琼脂糖水平电泳仪购自北京六一仪器厂，GeneGnome凝胶成像分析仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1位置特异性引物设计 于美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库下载ALDH2基因的基本信息。设计上游引物671-F3734(位于内含子11)和下游引物671-R165(位于内含子12)可特异性扩增含ALDH2 rs671SNP位点的片段。设计上游引物F1455(位于外显子11)和下游引物R1740(位于外显子13)可特异性扩增含ALDH2 rs671SNP位点对应的互补脱氧核糖核酸(cDNA)的片段。所有引物序列如下，671-F3734：5′-GTCCTGGGAGTGTAACCCAT-3′；671-R165：5′-CCCAGCAGGTCCTGAACTTC-3′；F1455：5′-GGACAAGGCCAATTACCTGT-3′；R1740：5′-ATTCAGCACGCAAGGATCAT-3′。

1.3.2DNA及总RNA提取、总RNA反转录为cDNA 根据红细胞裂解液产品说明书裂解人外周抗凝全血红细胞，分别用于提取DNA和总RNA。根据DNA和总RNA提取试剂盒说明书提取人外周抗凝全血白细胞 DNA和总RNA。取5 μg总RNA按照反转录试剂盒说明书进行反转录获得第一链RNA反转录cDNA。

1.3.3PCR扩增及测序 为了扩增位于外显子12的ALDH2 rs671SNP位点，以上游引物671-F3734和下游引物671-R165进行PCR扩增可鉴定受试者的ALDH2 rs671SNP；以上游引物F1455和下游引物R1740进行PCR扩增可鉴定ALDH2 rs671SNP位点对应的cDNA序列。引物示意图见图1A。PCR体系(25 μL)：2×Green Taq Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环后72 ℃延伸4 min。PCR产物经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据DNA纯化试剂盒说明书回收目的片段后进行测序。以DNA为模板的PCR产物用上游引物671-F3734进行测序，以cDNA为模板的PCR产物用上游引物F1455进行测序。

2 结 果

2.1PCR扩增白细胞的DNA和cDNA 用上游引物671-F3734和下游引物671-R165对白细胞的DNA进行PCR扩增的部分结果见图1B。用上游引物F1455和下游引物R1740对白细胞的cDNA进行PCR扩增的部分结果见图1C。

注：A为ALDH2 mRNA及引物示意图，仅展示ALDH2变异体1(Variant，V1)的3′端的3个外显子，▭代表外显子(E)，▭下方的数字表示外显子碱基对(bp)的长度，▼指示ALDH2 rs671SNP位点，→的位置表示引物的位置；B为PCR扩增白细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳部分结果；C为PCR扩增白细胞的cDNA琼脂糖凝胶电泳部分结果。图1 来自白细胞的DNA和cDNA PCR扩增产物电泳图

2.2PCR产物测序的结果 用上游引物671-F3734和下游引物671-R165对白细胞的DNA进行PCR扩增，PCR产物纯化后用上游引物671-F3734进行Sanger测序的结果见图2A，通过测序结果可鉴定受试者的ALDH2 rs671SNP。用上游引物F1455和下游引物R1740进行PCR扩增白细胞的cDNA，PCR产物纯化后以上游引物F1455进行Sanger测序的结果见图2B。在图2A和图2B中，当DNA在ALDH2 rs671SNP位点表现为杂合“GA”或纯合“AA”时，cDNA在对应的位点表现为鸟苷(G)，显示出DNA与cDNA测序结果不符的情况。

2.3ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3种基因型的基因频率和cDNA的表现型 48例受试者ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3种基因型的基因频率见图3A。在所研究的人群中，基因型为ALDH2 rs671(GG)的基因频率最高，基因型为ALDH2 rs671(AA)的基因频率最低(仅发现1例)。对48例受试者ALDH2 rs671SNP位点对应的cDNA的核苷酸序列进行计算，cDNA均表现为“G”，结果见图3B。

注：A为以白细胞的DNA进行PCR扩增后测序的结果，▼指示ALDH2 rs671SNP位点；B为以白细胞的cDNA进行PCR扩增后测序的结果，▼指示ALDH2 rs671SNP位点对应的cDNA的位点。图2 配对DNA与cDNA的测序结果

注：A为ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3种基因型的基因频率；B为ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3种基因型的cDNA表现型。图3 ALDH2 rs671(GG、GA、AA)的基因频率和cDNA的表现型

3 讨 论

ALDH2蛋白质是以四聚体的形式在体内发挥催化功能，基因型为杂合ALDH2 rs671(GA)的个体，主要是ALDH2蛋白质第504位谷氨酸→赖氨酸(504E→504K)的改变[14-15]。然而，这种改变会导致ALDH2蛋白质四聚体的稳定性下降，从而降低ALDH2蛋白质对乙醛的催化活性[16-17]。本研究的受试者中，基因型表现为杂合ALDH2 rs671(GA)的19例受试者，ALDH2 rs671SNP位点对应的cDNA都表现为“G”，并未检测到腺苷(A)(图2B)，理论上ALDH2 mRNA翻译出的蛋白质并不会出现ALDH2(504E→504K)的改变。矛盾的是，LAI等[18]报道基因型为杂合ALDH2 rs671(GA)的个体ALDH2蛋白质催化活性不到正常活性的1/2。因此，推测基因型表现为杂合ALDH2 rs671(GA)的受试者，ALDH2蛋白质催化活性明显降低并不完全是因为ALDH2(504E→504K)的改变。一种原因可能是仅ALDH2的等位基因(G)被转录，等位基因(A)不被转录，ALDH2 mRNA的量相对减少，造成ALDH2蛋白质的量相对不足，导致机体对乙醛的代谢活性出现异常。尽管未检测这些受试者ALDH2蛋白质对乙醛的催化活性。对于基因型表现为杂合ALDH2 rs671(GA)的受试者，也许机体认为等位基因(A)对于机体是“不利的”，因此，不转录等位基因(A)，而仅转录等位基因(G)。

RNA编辑被定义为一种协同/转录后修饰机制，通过在RNA水平上插入、删除或替换核苷酸，导致RNA序列与其模板DNA之间的差异来改变序列信息；这种修饰可以发生在编码区，从而重新编码氨基酸，具有典型的矫正功能；在哺乳动物中，由作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)催化的腺苷→肌苷(A→I)编辑是最常见的RNA编辑类型[19-20]。这种类型的RNA编辑在DNA水平表现为“A”，而对应的cDNA却表现为“G”，DNA与cDNA测序时出现A→G不符的情况[21-22]。在进行蛋白质翻译时，由于I通常被识别为G，因此A→I编辑也称为A→G编辑[23]。本研究中的48例受试者中基因型表现为罕见的纯合ALDH2 rs671(AA)的受试者，ALDH2 rs671SNP位点对应的cDNA也表现为“G”(图2B)，DNA与cDNA测序出现A→G不匹配。因此，推测基因型表现为罕见的纯合ALDH2 rs671(AA)的个体ALDH2 mRNA发生了(A→G)RNA编辑。有研究表明，基因型表现为纯合ALDH2 rs671(AA)时，ALDH2蛋白质的催化活性仅为正常活性的1%～5%[24]。然而，通过RNA编辑这种转录后的修饰机制，可以使原本DNA水平上异常的纯合ALDH2 rs671(AA)在RNA水平矫正为正常的“G”，这是RNA编辑典型的矫正功能，在进化上也是一种非常好的现象。

4 结 论

48例受试者中，19例基因型表现为杂合ALDH2 rs671(GA)的个体，ALDH2 rs671SNP位点对应的cDNA都表现为“G”，基因型表现为罕见的纯合ALDH2 rs671(AA)的个体，ALDH2 mRNA发生(A→G)RNA编辑，这些结果为ALDH2 rs671SNP如何影响人类健康的机制提供了新的见解。