胰岛素样生长因子-1基因转染对人牙髓干细胞体外矿化性能的影响

韩璧瑶，穆 睿，朱 磊，于泓川，毕 博，刘 鹃，陈 博，荣 亮，王 玥，史小蕾，帅 逸，臧圣奇，金 磊

0 引 言

因疾病或外伤导致的牙体与颌面部骨缺损严重影响患者的生活质量，如何构建牙体及骨组织再生治疗体系，是再生医学领域关注的热点问题。近年来，基因转染的迅猛发展为组织工程与再生医学提供了新的研究思路，基因转染的关键在于细胞载体、目的基因以及传递目的基因载体的选择。

人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)因具有多向分化潜能、自我更新能力、低免疫原性及不会增加患者痛苦等优点，不仅成为了牙体及骨组织再生领域的热点种子细胞，同时还成为基因转染优良的细胞载体[1-3]。生长因子是调控种子细胞分化的关键因素之一[4]，胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是牙体及骨组织修复的关键生长因子[5]，可通过不同的信号通路调控hDPSCs等间充质干细胞的成牙及成骨向分化[1,6]。然而目前大多数研究均采用外源性添加IGF-1蛋白直接诱导hDPSCs分化，该方法存在IGF-1蛋白生物半衰期短、反复及大剂量给药易产生不良反应、易被血液系统清除等问题，因此其应用受到了制约[7]。基因转染可靶向干预目的基因表达，且操作简便，克服了外源性蛋白诱导的诸多缺点，被视为具有前景的再生医学研究手段。目前利用基因转染靶向干预IGF-1表达，优化hDPSCs体外矿化性能的相关研究报道较少。本研究提出利用基因转染建立靶向调控IGF-1表达的hDPSCs模型，并探讨其对hDPSCs体外矿化性能的影响，为牙体及骨组织再生的研究发展及临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂IGF-1过表达慢病毒载体(汉恒，中国)，IGF-1低表达慢病毒载体(吉玛，中国)，IGF-1 Elisa试剂盒(四正柏，中国)，IGF-1抗体和GAPDH抗体(Affinity，美国)，牙本质涎磷蛋白(dentin sialophospho protein, DSPP)抗体(博奥森，中国)，骨钙素抗体(Proteintech，中国)，CCK-8试剂盒(诺唯赞，中国)，ALP检测试剂盒(碧云天，中国)，茜素红染液和CPC(Sigma，美国)。

1.2方法

1.2.1 细胞分离培养及表型鉴定取新鲜第三磨牙分离牙髓，利用组织块-酶消化法结合有限稀释法分离、纯化和扩大培养hDPSCs。收集细胞后加入1 mL含3%FBS的PBS重悬，按1×105个细胞/管分装至1.5 mL EP管中，加入荧光抗体，室温避光孵育1 h，用流式细胞仪检测。

1.2.2克隆形成能力及多向分化能力检测按200个细胞/孔接种于6孔板中，培养14 d后,加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，洗涤后加入1 mL 0.1%甲苯胺蓝避光染色20 min，细胞数量≥50个称为一个集落形成单位。

按3×105个细胞/孔接种于6孔板中，融合度大约80%时，换用矿化诱导液或成脂诱导液，诱导21 d后，加入1 mL 4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤，矿化诱导加入2 mL茜素红染液，成脂诱导加入2 mL油红O染液，避光孵育10 min，镜下观察。

1.2.3细胞培养及转染以2×105个细胞/孔接种至6孔板中，当细胞汇合度约40%-50%时，分别加入过表达IGF-1慢病毒、低表达IGF-1慢病毒及对应空载体。其中IGF-1过表达设置以下3组：hDPSCs-1组(hDPSCs未转染)、Con-over组(hDPSCs转染空载体)、IGF-1-over组(hDPSCs转染过表达IGF-1慢病毒)。而IGF-1低表达设置以下3组：hDPSCs-2组(hDPSCs未转染)、Con-inhibition组(hDPSCs转染空载体)、IGF-1-inhibition组(hDPSCs转染低表达IGF-1慢病毒)。

1.2.4qRT-PCR转染7 d后，提取细胞内RNA，按照产品说明书去除DNA，逆转录，并挑选引物进行qRT-PCR程序，引物序列为，IGF-1上游引物序列：5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3'；下游引物序列：5'-CGCAATACATGTCCAGCCTC-3'；DSPP上游引物序列：5'-TTTGGGCAGTAGCATGGGC-3'；下游引物序列：5'- CCATCTTGGGTATTCTCTTGCCT-3'；骨钙素上游引物序列：5'-CCCAGGCGCTACCTGTATCAA-3'；下游引物序列：5'-GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；下游引物序列：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。qRT-PCR程序反应条件为预变性：95 ℃ 10 min；变性：95 ℃ 20 s；退火：60 ℃ 30 s延伸；72 ℃ 30 s，用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

1.2.5Western blot转染7 d后，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，配置SDS-PAGE凝胶，电泳，转移蛋白至PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃条件下一抗孵育过夜(8 h以上)，PBS洗涤，室温条件下二抗孵育1 h，PBS洗涤，将PVDF膜浸入ECL发光液，显影曝光。

1.2.6Elisa法第3、5、7天向上清液中加入100 μL 1 mol/L HCl，室温孵育后加入100 μL 1 mol/L NaOH，再加入50 μL生物素化抗体工作液，室温震荡2 h，PBS洗涤，加入酶结合物工作液辣根过氧化酶，37 ℃孵育30 min，洗涤，加入显色剂3,3',5,5'-四甲基联苯胺，37 ℃孵育10 min，测定A450nm。

1.2.7CCK-8法第1、3、5、7、9天吸去细胞培养液，按体积比1∶10加入CCK-8和含10%FBS的α-MEM培养基，混匀，37 ℃孵育1 h，测定A450nm。

1.2.8ALP活性检测第5、9天提取细胞总蛋白，空白对照孔加入缓冲液和底物，标准品孔加入标准品和缓冲液，样品孔加入样品和底物，37 ℃孵育30 min，测定A405nm。

1.2.9茜素红染色及基质钙含量评估转染第21天后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤，茜素红染液作用20 min，加入10 mmol/L CPC溶液，于摇床轻晃15 min，测定A562nm。

2 结 果

2.1 hDPSCs培养及鉴定hDPSCs细胞呈成纤维细胞样，贴壁生长；克隆集落染色可见蓝染的克隆散在分布；成骨及成牙诱导分化茜素红染色可见密集的红染矿化结节；成脂诱导分化油红O染色可见大量红染的脂滴颗粒，见图1。流式细胞仪显示尖耸单峰，表明所培养细胞具有良好的同质性，且阳性表达CD29、CD90、CD105、CD146及STRO-1，阴性表达CD34和CD45，见图2。均符合hDPSCs的生物学特征，证明已成功分离培养hDPSCs。

2.2IGF-1基因水平验证与hDPSCs-1组、Con-over组IGF-1基因表达量(0.96±0.04、0.82±0.59)比较，IGF-1-over组(14.07±0.25)显著升高(P<0.01)。与hDPSCs-2组、Con-inhibition组IGF-1基因表达量(0.96±0.04、1.02±0.05)比较，IGF-1-inhibition组(0.06±0.01)显著降低(P<0.01)。

2.3IGF-1蛋白水平验证hDPSCs-1组与Con-over组IGF-1表达差异无统计学意义(P>0.05)，IGF-1-over组的IGF-1蛋白表达显著高于hDPSCs-1组、Con-over组(P<0.01)。hDPSCs-2组与Con-inhibition组IGF-1表达差异无统计学意义(P>0.05)，IGF-1-inhibition组的IGF-1蛋白表达显著低于hDPSCs-2组、Con-inhibition组(P<0.01)，见图3、图4。

a：细胞形态； b：克隆集落染色 ； c：茜素红染色； d：脂滴染色

图 2 流式细胞仪鉴定细胞表面标记

1:hDPSCs-1组;2:Con-over组;3:IGF-1-over组;4：hDPSCs-2组；5:Con-inhibition组;6：IGF-1-inhibition组

1:hDPSCs-1组;2:Con-over组;3:IGF-1-over组;4：hDPSCs-2组；5:Con-inhibition组;6：IGF-1-inhibition组

2.4IGF-1分泌水平验证转染第3、5、7天后，IGF-1-over组IGF-1分泌量较hDPSCs-1组、Con-over组明显升高(P<0.01)。转染第3、5、7天后，IGF-1-inhibition组IGF-1分泌量较hDPSCs-2组、Con-inhibition组明显下降(P<0.01)，见表1。

表 1 不同组别各时间点IGF-1分泌蛋白表达的比较

2.5hDPSCs增殖能力检测hDPSCs-1组、Con-over组与IGF-1-over组增殖速度基本一致，各时间点组间差异无统计学意义(P>0.05)。hDPSCs-2组、Con-inhibition组与IGF-1-inhibition组间各时间点增殖速度差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

2.6ALP活性检测第5天，hDPSCs-1组、Con-over组与IGF-1-over组ALP活性差异无统计学意义(P>0.05)；第9天，与hDPSCs-1组、Con-over组ALP活性比较，IGF-1-over组显著升高(P<0.05)。第5天，IGF-1-inhibition组ALP活性较hDPSCs-2组明显升高(P<0.05)，见表2。

2.7矿化结节形成及基质钙含量检测与hDPSCs-1组、Con-over组比较，IGF-1-over组可产生更多矿化结节，染色程度更深，基质钙含量更高(P<0.01)。hDPSCs-2组、Con-inhibition组与IGF-1-inhibition组茜素红染色及基质钙含量差异无统计学意义(P>0.05)，见图6、图7。

图 5 细胞增殖能力变化

表 2 不同组别各时间点的ALP活性变化

a:hDPSCs-1组;b:Con-over组;c:IGF-1-over组;d：hDPSCs-2组；e:Con-inhibition组;f：IGF-1-inhibition组

1:hDPSCs-1组;2:Con-over组;3:IGF-1-over组;4：hDPSCs-2组；5:Con-inhibition组;6：IGF-1-inhibition组

2.8qRT-PCR和Western blot分别检测DSPP和骨钙素的mRNA和蛋白表达IGF-1-over组DSPP基因、蛋白的表达较hDPSCs-1组、Con-over组显著升高(P<0.01)，骨钙素表达亦升高(P<0.05)。IGF-1-inhibition组DSPP基因、蛋白的表达较hDPSCs-2组、Con-inhibition组显著降低(P<0.01)，骨钙素蛋白表达亦降低(P<0.05)，见表3，图8、表4。

表 3 不同组别hDPSCs矿化相关基因表达的比较

1:hDPSCs-1组;2:Con-over组;3:IGF-1-over组;4：hDPSCs-2组；5:Con-inhibition组;6：IGF-1-inhibition组

表 4 不同组别hDPSCs矿化相关蛋白相对表达量的比较

3 讨 论

本研究旨在利用基因转染优化hDPSCs体外成牙及成骨分化潜能，为牙体及骨组织再生提供新的调控策略。基因转染技术首要考虑的问题是选择安全高效的传递目的基因的载体。目前，基因传递载体主要包括两类，一类是非病毒载体，转染效率较低；另一类是病毒载体，其中γ-逆转录病毒有诱导细胞免疫反应的风险，并且无法短时间内制备高滴度病毒；腺病毒仅可介导目的基因瞬时表达；腺相关病毒则存在携带基因片段过小和复制缺陷的问题，这些问题均限制了上述载体的广泛应用；而慢病毒不仅可介导基因持续表达，还可转染静止细胞与分裂细胞，其安全性高，便于操控，近年来广泛应用于各类疾病的研究中[8-9]。基于慢病毒的优越性，本研究选择其作为IGF-1基因转染的载体。

Lin等[10]用介导IGF-1的慢病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)，可显著上调培养基中IGF-1含量。Zhang等[11]利用低表达环氧合酶-1、聚蛋白多糖酶同时过表达hIGF-1的慢病毒转染BMSCs，发现空白对照组与空载体组组间环氧合酶-1、聚蛋白多糖酶及IGF-1表达无显著差异，而慢病毒转染组环氧合酶-1、聚蛋白多糖酶表达降低，IGF-1表达升高，促进食蟹猴磨损的膝关节软骨的修复；BMSCs具有多向分化潜能，是牙体及骨组织再生中常用的种子细胞，但创伤大、细胞获取过程痛苦[12]；hDPSCs具备低免疫原性及不会增加患者痛苦等优势，因此本研究选择hDPSCs作为基因转染的细胞载体，然而过表达和低表达IGF-1慢病毒载体能否成功整合至hDPSCs基因组中，并干预其表达、合成IGF-1基因和蛋白能力目前尚不清楚。本研究利用qRT-PCR、Western blot评估IGF-1的基因、细胞内蛋白表达水平，同时由于hDPSCs通过分泌IGF-1激活IGF-1R下游信号通路，调节细胞内环境稳态和功能，因此同时采用Elisa检测IGF-1蛋白分泌水平的变化[13-14]，以明确IGF-1慢病毒转染hDPSCs的效果。本研究结果表明过表达IGF-1慢病毒转染hDPSCs可上调hDPSCs中IGF-1表达，低表达IGF-1慢病毒转染hDPSCs可下调hDPSCs中IGF-1表达，克服了外源性蛋白刺激半衰期短及易被血液系统清除等缺点。

本研究结果表明，过表达IGF-1慢病毒转染hDPSCs后不影响其增殖能力。相较于hDPSCs-1组与Con-over组，IGF-over组ALP活性、钙化结节茜素红着色程度、基质钙含量以及DSPP和骨钙素的基因、蛋白表达均显著升高，提示过表达IGF-1慢病毒转染可增强hDPSCs的成牙及成骨分化能力。Xing等[15]将转染IGF-1的BMSCs移植至糖尿病鼠骨折处，发现形成的骨痂中IGF-1含量显著上调，且血清中IGF-1含量至第7周仍保持高浓度，显著促进骨折部位愈合。Frisch等[16]也发现相较于使用IGF-1蛋白，体外转导IGF-1基因可使人间充质干细胞持续高效合成IGF-1，改善其成软骨效果。本研究结果与上述研究结果类似。

本研究结果表明，低表达IGF-1慢病毒转染hDPSCs后不影响其增殖能力。随着IGF-1基因及蛋白的下调，相较于hDPSCs-2组与Con-inhibition组，IGF-inhibition组DSPP和骨钙素的表达均显著降低，说明低表达IGF-1慢病毒可负向调控hDPSCs成牙及成骨能力。对于ALP活性、茜素红染色和基质钙含量未见显著差异的现象，可能由于诱导hDPSCs成牙及成骨分化的生物活性分子众多，包括转录因子、受体分子以及组织特异性蛋白等，各因子相互作用及对hDPSCs产生的调控作用代偿了DSPP、骨钙素对hDPSCs分化的影响，从而导致低表达IGF-1慢病毒转染对hDPSCs成骨表型的影响未能体现出来。

综上所述，本研究发现慢病毒转染可有效干预hDPSCs中IGF-1的表达，克服了外源性IGF-1蛋白直接诱导存在的蛋白生物半衰期短等问题；过表达IGF-1慢病毒转染可增强hDPSCs的成牙及成骨向分化能力，低表达IGF-1慢病毒转染可抑制hDPSCs的成牙及成骨向分化能力，为牙体及骨组织缺损提供了新的研究思路。