诱导型一氧化氮合成酶在胃腺癌表达特点及与淋巴管形成的关系

王嘉鑫，闫志军，石安华，刘宥苡，吕 煜，陈 芸,代佑果

0 引 言

胃癌的发生发展是一个多阶段的复杂过程，涉及到肿瘤细胞与宿主细胞的黏附性、细胞外基质的酶解及肿瘤血管生成等过程[1-3]。在此过程中多种机制参与了肿瘤的发展，其中淋巴结转移是胃癌癌细胞侵袭的首要步骤[4]。胃癌患者转移的主要途径是淋巴系统，淋巴结受累的程度是影响患者生存率的主要因素[5-6]。

肿瘤淋巴管浸润是一个复杂的、多因素参与的过程。原发肿瘤病灶中，肿瘤细胞侵袭淋巴管是第一步。淋巴管浸润和淋巴结转移是胃癌进展中最重要的步骤[7]。NO作为一种信号分子，在炎症和癌变过程中起着重要作用[8-9]。近年来，研究表明NO在肿瘤的淋巴管形成及结转移中起着重要作用[10]。生理状态下，NO由淋巴管内皮细胞合成，调节着淋巴的渗透和流动。肿瘤环境中，肿瘤细胞产生的过量NO可增加淋巴管通透性，调节淋巴管舒张，从而促进通过淋巴管浸润所致的癌细胞蔓延。此外，NO可通过增加VEGF-C/VEGF-D和VEGF-R2 /VEGF-R3的表达，从而促进淋巴管形成[11-12]。而诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)作为病理状态下体内合成NO的主要催化剂，近年来发现其与胃癌的淋巴管形成有密切关系[1]。D2-40是O-连接、唾液酸糖蛋白podoplamin表面的固定性抗表位，可表达于淋巴管内皮细胞。然而，iNOS表达与胃癌淋巴管形成及淋巴结转移的关系研究较少。本研究旨在探讨胃腺癌组织中iNOS表达，及与淋巴管形成的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2017年7月至2018年12月昆明医科大学第三附属医院(云南省肿瘤医院)腹部外科78例胃癌根治术患者的癌组织及癌旁组织标本。纳入标准：术前未行新辅助化放疗；所有患者外科手术切缘为阴性；无肝、肺等远处器官转移；无其它先前的或伴随原发癌症。排除标准：严重心血管疾病、呼吸道疾病或糖尿病、上消化道梗阻、穿孔和出血、严重感染需要治疗的患者。78例胃腺癌患者中，男46例，女32例，平均年龄(53.2 ± 7.4)岁，参照国际抗癌联盟第八版AJCC胃癌临床TNM分期标准：T1期12例、T2期14例、T3期27例、T4期25例；N0期 13例、N1期 17例、N2期 20例、N3期 28例。本研究经昆明医科大学第三附属医院伦理委员会批准(批准号：ky201724)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂iNOS、D2-40鼠抗人一抗购自美国Abcam公司，免疫组化SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法癌组织及癌旁组织均用10%中性缓冲甲醛固定48 h，石蜡包埋，依据标准病理规范，对组织切片(4 μm)进行脱蜡，抗原提取在pH=6的柠檬酸盐缓冲液中进行，微波时间为5 min。应用免疫组织化学SP法进行iNOS和D2-40蛋白染色，按照试剂盒说明书进行操作。2个指标的蜡块处理、切片、抗原修复及染色过程均相同，二氨基联苯胺(DAB)显色后，苏木精复染细胞核，氨水反蓝后，于75%、85%、95%、100%无水乙醇中浸泡切片10 min，脱水，将切片放入二甲苯中浸泡10 min，取出切片封片。每张切片镜下选取5个高倍镜视野进行统计。iNOS为细胞质、细胞核周围微管染色，D2-40为细胞膜和胞浆染色。免疫组化结果判断标准[1]，抗体免疫组化染色强度的评估通过着色反应分为 4 分：1为弱；2为中度；3为强；4为超强度。免疫染色量的评分为，0：无阳性免疫染色；1：≤25%；2：25%～49%；3：50%～75%；4： ≥75%细胞呈免疫阳性。通过将定性和定量的评分相加，得到总分，然后分成：(-)为无表达免疫组化染色(0分)；(+)为低表达免疫组化染色(1-2 分)；(2+)为中表达免疫组化染色(3-4分)；(3+)为高表达免疫组化染色(>5分)。阳性率计算公式为：

阳性率=(+)+(2+)+(3+)/总数

2 结 果

2.1 iNOS在胃腺癌组织及癌旁组织中的表达癌组织中iNOS阳性表达率为64.10%(50/78)，其中低表达免疫组化可见肿瘤组织细胞质、细胞核周围抗体着色弱，且染色量≤25%；中表达免疫组化可见肿瘤组织细胞质、细胞核周围抗体着色中度，且染色量25%～49%；高表达免疫组化可见肿瘤组织细胞质、细胞核周围抗体着色强或超强，且染色量≥50%，见图1。胃腺癌组织的iNOS蛋白阳性表达率(50/78，64.10%)高于癌旁组织(40/78，51.3%)，差异有统计学意义(P=0.014)。

2.2 D2-40在胃腺癌组织及癌旁组织中的表达癌组织中D2-40阳性表达率为73.08%(57/78)，其中低表达免疫组化可见肿瘤组织细胞膜和胞浆抗体着色弱，且染色量≤25%；中表达免疫组化可见肿瘤组织细胞膜和胞浆抗体着色中度，且染色量25%～49%；高表达免疫组化可见肿瘤组织细胞膜和胞浆抗体着色强或超强，且染色量≥50%，见图2。D2-40蛋白在胃腺癌组织的阳性表达率(57/78，73.08%)高于癌旁组织的阳性表达率(47/78，60.3%)，差异有统计学意义(P=0.003)。

图示癌组织中iNOS蛋白阳性表达高于癌旁组织

图示癌组织中D2-40蛋白阳性表达率高于癌旁组织

2.3iNOS与D2-40表达的相关性胃腺癌组织中iNOS和 D2-40 的表达呈显著正相关(rs=0.532，P=0.001)。

2.4iNOS表达与胃腺癌临床病理特征的关系胃腺癌组织中iNOS的表达水平与肿瘤分化程度有关，低分化腺癌阳性表达率较高中分化明显升高(P=0.041)。此外，iNOS阳性表达率随着临床T分期和N分期越晚越高(P< 0.05)。见表1。

表 1 iNOS表达与胃腺癌临床病理特征的关系(n)

3 讨 论

近年来，研究表明NO在肿瘤淋巴管形成及淋巴结转移中起着重要作用。而iNOS作为病理状态下体内合成NO的主要催化剂，近年来发现其与胃癌的淋巴管形成有密切关系[1]。NOS按其存在的部位及作用机制可分为结构性NOS和诱导型NOS。其诱导产生的NO在维持胃黏膜的完整性方面具有功能多样性和两面性[13]。在正常生理条件下，由结构性NOS催化产生的低浓度NO可调节胃黏膜血供、胃酸和碳酸盐的分泌，对胃黏膜起保护作用；而在病理状态下，内毒素、IFN-γ、IL-1、TNF-α及肿瘤生长因子-β等可刺激iNOS大量产生，iNOS催化产生的高浓度NO可导致氮氧自由基形成并使胺硝化成亚硝胺，诱发DNA突变，从而引发炎症及肿瘤[14-16]。

iNOS作为病理状态下产生高浓度NO的主要因子，在肿瘤细胞恶性增殖和转移过程中发挥着重要作用。炎症状态下，iNOS主要表达于巨噬细胞和中性粒细胞。而在肿瘤组织，肿瘤细胞亦是iNOS的主要来源。Karaday等[1]研究显示胃癌患者为中度至高度iNOS表达。本研究表明，iNOS在胃腺癌组织阳性表达率为64.10%，明显比癌旁组织高(P<0.05)，与文献报道[17]一致。黎玉容等[18]认为，在胃癌组织中iNOS的表达水平和肿瘤的分级有关。本研究也表明，iNOS在胃腺癌组织的表达与组织分化程度相关，低分化腺癌较高中分化腺癌阳性表达率高。

肿瘤细胞iNOS表达与炎症密度、分化缺失、淋巴管形成及淋巴管扩散有明显的联系。iNOS表达增加可诱导肿瘤相关炎症反应和淋巴管形成[1]。本研究通过淋巴管特异性标记物D2-40与iNOS表达关系的免疫组化检测发现，两者呈明显的正相关关系，提示iNOS在胃腺癌淋巴管形成、浸润和转移中扮演着重要作用。并且，iNOS表达与T分期、N分期密切相关，分期越晚，表达率越高。

综上所述，本研究结果表明，iNOS在胃腺癌组织呈高表达，iNOS表达与肿瘤组织分化程度、T分期和N分期相关，与胃腺癌组织淋巴管形成存在密切关系。iNOS作为病理状态下产生高浓度NO的主要催化酶，在胃癌淋巴管形成中发挥着重要作用，具有潜在靶向治疗的价值，值得进一步研究。