新型冠状病毒特异性抗体的动态变化和临床意义

熊亚莉，徐庆庆，唐 健

0 引 言

自2019年12月以来，国内外相继发生新型冠状病毒导致的肺炎，目前已经是全球大流行，WHO命名为“2019冠状病毒病”(COVID-19)。该病原体是一种新的冠状病毒，被命名为2019严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，简称新型冠状病毒。国家卫健委诊疗规范第七版[1]之前是将核酸检测作为确诊新型冠状病毒肺炎的金标准，但核酸检测存在假阴性，而特异性抗体检测可以作为核酸检测的重要补充[2]，目前已被纳入确诊标准之一[1]。新型冠状病毒特异性IgM抗体多于发病3～5 d后开始产生[1]，IgG抗体可在10～15 d产生[3]。但病程中新型冠状病毒特异性抗体的变化情况尚不清楚。本研究拟探讨新型冠状病毒特异性IgM、IgG抗体的动态变化特点，并进一步明确特异性抗体检测在新型冠状病毒肺炎诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性分析2020年2月至3月南京鼓楼医院援鄂医疗队在华中科技大学附属同济医院光谷院区收治的59例新型冠状病毒肺炎的患者。确诊标准参见国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》第七版[1]，患者均有临床流行病学史，符合3条临床表现的2条及以上[发热和(或)呼吸道症状、影像学显示双肺有磨玻璃影或斑片影、发病早期血常规白细胞正常或减低、淋巴细胞减少或减低]，及病原学或血清学证据之一(实时荧光定量RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性，或血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性，或血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性，或恢复期较急性期4倍及以上升高)。

1.2 检测方案入院时每例患者行特异性IgM、IgG抗体检测以及咽拭子新型冠状病毒核酸检测。IgM抗体或核酸检测阳性者，1周后复查，直至IgM抗体转阴或核酸两次以上阴性出院时为止。另予检测血常规、生化全套(肝功能、血脂、空腹血糖、肾功能、尿酸、乳酸脱氢酶等)、淀粉酶、肌酸激酶、肌钙蛋白I、凝血五项(凝血酶原时间、活化凝血酶原时间、纤维蛋白原、凝血酶时间、D-二聚体)、淋巴细胞亚群、细胞因子谱、胸部CT等，根据结果定期复查。

1.3 试剂新型冠状病毒特异性IgM及IgG抗体定量检测：空腹采血，采用深圳亚辉龙生物科技有限公司的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试剂盒进行检测(化学发光法，批号：20200206)，正常值参考范围为≤10U/mL。新型冠状病毒ORF1ab/N基因双重核酸检测：采用中山大学达安基因股份有限公司的新型冠状病毒检测试剂盒进行扩增分析(荧光定量RT-PCR法)。

2 结 果

2.1患者临床特征及入院时实验室检查59例患者入院时平均病程(3.81±2.2)周。合并症中最常见的是高血压病，其次是脑梗死、糖尿病及冠心病。60%以上患者起病有发热或咳嗽症状。见表1。血常规中淋巴细胞减少最常见。淋巴细胞亚群分析显示约25%患者CD4、CD8、NK细胞数量降低，而B细胞数量降低相对少见。5%～39%患者并发肝、肾、胰腺、心肌、凝血等器官系统功能损害。见表2。

2.2新型冠状病毒特异性抗体及核酸检测的敏感性分析59例患者住院期间抗体和核酸检测分别为107人次、148人次。9例(15.3%)患者入院前后连续3次以上新冠病毒核酸检测均呈阴性，但入院后特异性IgG抗体均呈阳性，其中7例(11.9%)患者IgM抗体同时呈阳性；且另有2例患者核酸检测阳性，IgM、IgG抗体却均呈阴性。核酸检测敏感性为84.74%(50/59)，IgG抗体检测敏感性为96.61%( 57/59)，但两者差异无统计学意义(P=0.065)。见表3。

表 1 本组新型冠状病毒肺炎患者的临床特征

表 2 新型冠状病毒肺炎患者入院时的异常实验室指标

表 3 新型冠状病毒特异性IgM、IgG抗体与核酸检测阳性结果比较(n)

2.3新型冠状病毒特异性抗体及核酸动态变化

2.3.1 新型冠状病毒特异性抗体及核酸检测标本每周阳性率148人次新型冠状病毒核酸检测中，最早病程第2周即有检测呈阴性者，最晚第8周时仍有1例次呈阳性。107人次新冠病毒特异性抗体检测中，2例患者共3人次IgM、IgG检测均呈阴性，分别处于病程第4、6和7周。IgM 抗体检测最早病程第3周即有1人次呈阴性，最晚第9周时仍有1人次呈阳性。IgG抗体检测在病程第2-9周中除2例患者3人次外呈阴性外，其余均呈阳性。见图1。

图 1 新型冠状病毒特异性抗体及核酸每周检测阳性率

2.3.2 新型冠状病毒特异性抗体滴度变化59例患者病程第2-4周新型冠状病毒特异性IgM 抗体滴度为32.09(6.87，74.95)U/mL，第5-6周为29.72(11.39，56.62)U/mL，第7-9周为13.8(6.89，27.76)U/mL，仅第5-6周与第7-9周IgM 抗体滴度差异有统计学意义(P=0.02)。第2-4周新型冠状病毒特异性IgG抗体滴度为102.66(61.33，202.56)U/mL，第5-6周为158.80(95.40，208.76)U/mL，第7-9周为88.35(75.70，104.29)U/mL，仅第5-6周与第7-9周IgG 抗体滴度差异有统计学意义(P=0.01)。见图2。

2.3.3 新型冠状病毒特异性抗体及核酸检测转阴时间在住院期间的连续检测中，37例(62.7%)患者新型冠状病毒核酸由阳性转为阴性，转阴时间为病程(5.76±1.95)周；15例(25.4%)患者新型冠状病毒特异性IgM抗体发生转阴，转阴时间为病程(6.73±1.48)周；无患者在9周病程内发生新型冠状病毒特异性IgG抗体转阴。

2.4新型冠状病毒特异性IgM抗体及核酸转阴的影响因素单因素分析显示CD4细胞计数减低(P=0.047)、IL-2R水平增高(P=0.025)与IgM抗体转阴相关。多因素分析显示CD4细胞计数减低(HR：3.541， 95%CI：1.014～12.364)、IL-2R水平增高(HR ：5.450，95%CI：1.048～28.340)是IgM抗体转阴的影响因素(P<0.05)。见表4。

*P<0.05

表 4 新型冠状病毒特异性IgM抗体转阴的影响因素分析

3 讨 论

特异性抗体的检测是目前很多感染性疾病的常规诊断方法，如果患者体内存在类风湿因子、自身抗体等可以导致抗体检测出现假阳性可能[4]，但目前研究显示新型冠状病毒特异性IgM、IgG抗体检测的特异性相对较高，为90%～96%[5-7]。本研究中存在9例核酸检测阴性、特异性抗体检测阳性的患者，这部分患者流行病学及临床特征均符合新型冠状病毒肺炎的疑似诊断标准，且特异性抗体滴度有动态变化，故考虑抗体检测为假阳性可能极小。对于疑似患者，尤其是核酸反复检测呈阴性者，特异性IgM、IgG抗体应该作为常规检测方法之一，这样能减少因病毒载量极低或采样所致的核酸检测假阴性带来的漏诊。由于操作或标本保存问题，抗体检测也存在假阴性可能，文献报道新型冠状病毒特异性抗体检测的敏感性为85%～92%[5-7]。临床研究和专家共识显示化学发光法灵敏度高于胶体金法，具有操作方便、准确性高、稳定性好等优点[8-9]。本研究显示2例患者多次核酸检测呈阳性，结合流行病学及临床特征均符合新型冠状病毒肺炎的确诊标准，而IgM、IgG抗体定量检测均为阴性，检测时间分别为病程的第4周及第6-7周，据文献报道新型冠状病毒特异性IgM抗体检测的窗口期可能为8 d左右，这2例患者已过窗口期，故考虑检测结果阴性非病程所致[5]。但即使如此，本研究显示联合IgM、IgG抗体检测敏感性仍可达96.61%。可见，新冠病毒特异性IgM、IgG抗体定量检测可以作为一项很好的诊断指标，对于新型冠状病毒感染疑似患者的确诊以及无症状感染者的筛查具有重要意义[10]。由于存在“窗口期”，抗体检测可能出现“假阴性”，由于交叉反应、内源性或外源性干扰物的影响，导致“假阳性”结果，因此强调多次动态检测抗体以提高诊断的准确性[11]。

有文献报道，在病程15～30 d时新型冠状病毒特异性IgM抗体检测阳性率最高，病程15 d后、出院后14 d与病程7 d以内的IgM抗体水平相比有统计学差异[5]。另有文献报道，IgM抗体8 d后阳性率达100%，28 d后IgM抗体开始消失[6]，但尚少有IgM抗体在病程4周以后滴度的变化以及转阴情况的报道。本研究显示病程第3周及第5周时IgM抗体检测阳性率最高，分别为83.33%和76%。第2-4周与第5-6周IgM抗体滴度没有明显差别，而第7-9周较第5-6周有明显下降(P=0.02)，显示第7周以后IgM抗体滴度下降明显。本研究没有发现IgM滴度的早期峰值，考虑与本研究中患者入院时病程普遍偏晚有关。但重要的是，本研究动态检测发现15例患者住院期间发生了IgM抗体的转阴，转阴时间在病程的(6.73±1.48)周，故IgM抗体可能可用于起病或隐性感染7周以内现症感染的诊断。IgG抗体滴度在第5-6周高于第2-4周，但差异无统计学意义，这同样不排除本研究早中期患者样本量偏少所致。第7-9周滴度较第5-6周明显下降(P=0.01)，虽然在病程第7周以后IgG抗体滴度也有下降，但病程第9周时滴度仍然明显高于正常值，且没有患者在此期间转阴。因此，本研究提示，IgG抗体至少可用于起病或隐性感染9周以上的恢复期或既往感染的诊断。而IgG抗体持续阳性的更长时间节点有待于对患者长期随访后确定。本研究初步探讨了新型冠状病毒肺炎病程不同时间段IgM、IgG抗体的变化特点，同其他很多感染性疾病一样，新型冠状病毒特异性IgM与IgG抗体滴度也呈升高、下降的动态变化过程，通过动态检测、联合检测能有助于判断患者病程阶段。

既往在SARS中研究显示，患者病情越重，病毒特异性抗体滴度越高，高峰期延迟[12]。新型冠状病毒肺炎特异性抗体变化特点尚不完全清楚，其转阴影响因素亦未见报道。目前认为，新型冠状病毒肺炎后期病情的恶化可能是病毒诱导的细胞因子风暴所致[13]。研究表明，患者CD4+T、CD8+T细胞活化增加、数量减少，同时B细胞减少，DC细胞和B细胞活化亦减少。CD4+T细胞功能的代偿性增强，最终导致了细胞因子风暴[14]。免疫活化时，CD4+T细胞表达CD25，可溶性CD25(也即是IL-2R)释放进入血流，因此IL-2R水平体现了CD4+T细胞的活化程度。随着疾病严重程度的增加，IL-6、TNF-α等促炎细胞因子水平显著增加，IL-2R的浓度与IL-6、TNF-α呈正相关，与淋巴细胞数量负相关，IL-2R与淋巴细胞数量的比值能预测患者预后[15]。本研究发现IL-2R是IgM抗体转阴的独立影响因素，提示患者IL-2R水平越高，IgM抗体转阴时间可能越长。IL-2R升高与IgM抗体阴转之间的相关性体现了机体细胞免疫与体液免疫反应之间的某种关联，但具体机制有待进一步研究。本研究中，B细胞数量与新型冠状病毒IgM抗体转阴之间没有发现明确相关性。但由于本研究病例数较少，尚有待于扩大样本数量验证上述结论，同时也有必要进一步开展基础研究明确新型冠状病毒对机体细胞免疫和体液免疫的影响。

综上所述，本研究明确了病毒特异性IgM、IgG抗体检测对于新型冠状病毒肺炎的诊断、尤其是核酸阴性患者的诊断具有重要价值，通过对病程中IgM、IgG抗体滴度的变化特点、IgM抗体转阴时间的分析，提示特异性IgM、IgG抗体滴度的动态变化可能有助于病程判断，而IgG抗体留存时间较长，对于至少9周以上的感染者、尤其是无症状既往感染者具有诊断价值。但本研究也存在一些缺陷，如纳入样本数不多、检测时间点不完全统一、观察到转阴的病例数较少、缺乏长期随访结果等，有待于今后进一步完善和通过其他研究进行验证。