酶法制备玉米胚芽ACE抑制肽的研究

高泽汝，宁梦茹，刘昆仑，陈复生

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

高血压可导致许多严重疾病，包括心肌梗死、脑出血、肾衰竭和中风等，已成为危害人类生命的“无形杀手”，当前世界上的高血压人数已超过10亿[1]。血管紧张素转化酶(ACE)是一种锌金属肽酶，同时显示内肽酶和外肽酶两种特性，可作用多种底物，主要通过两种途径引起血压的上升：(1)催化肾素-血管紧张素系统，生成一种强有效的血管收缩剂——血管紧张素Ⅱ；(2)影响激肽释放酶-激肽系统，促使缓激肽催化功能的减弱与失活[2]。因此，ACE抑制剂常作为一线药物对高血压进行预防及控制。食源性ACE抑制肽由于天然健康、安全有效、低毒副作用成了研究者的关注焦点。近年来国内外学者已经从核桃、葵花籽、花生、鹰嘴豆、西兰花等多种物质中分离获得ACE抑制肽[3-7]。

玉米胚芽是玉米籽粒的“生命之源”，脂肪、蛋白和灰分含量较高，其中玉米胚芽蛋白含有全部的必需氨基酸，是植物蛋白的极佳来源，但未得到很好的开发利用[8]。玉米胚芽蛋白酶解物，特别是小分子量的组分，具有调节和预防某些疾病的生理特性，可作为抗高血压和抗氧化剂[9]。Parris等[10]选用4种酶酶解玉米胚芽蛋白，发现大多数ACE抑制肽分子质量小于1 kDa；Zhang等[11]从玉米胚芽蛋白中分离出3种抗氧化肽，具有较高的自由基清除、氧自由基吸收等抗氧化能力。

作者以玉米胚芽为原料，酶法制备玉米胚芽ACE抑制肽，探究蛋白酶种类及酶解工艺对ACE抑制率的影响，并采用响应面法明确最佳制备工艺，以期为ACE抑制肽的医学应用及功能性食品的发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米胚芽：山东三星玉米产业科技有限公司；碱性蛋白酶(200 U/mg)、风味蛋白酶(20 U/mg)、胃蛋白酶(30 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)：上海源叶生物科技有限公司； N- [3-(2-呋喃基)丙烯酰基]-Phe-双甘氨酸(N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly，FAPGG)、血管紧张素转化酶(ACE)：美国Sigma-Aldrich试剂公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SQP电子天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司； JJ-6六联电动搅拌器：常州普天仪器制造有限公司；GL-10000 C高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博运实业有限公司医疗设备厂；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；TECAN酶标仪：美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

使用万能粉碎机粉碎玉米胚芽，以料液比1∶6(g/mL)加入正己烷振荡脱脂，重复3次，置于通风橱晾干，过100目筛，密封于-20 ℃干燥避光处保存，备用。

1.3.2 玉米胚芽ACE抑制肽的制备工艺

玉米胚芽脱脂粉→加入去离子水(料液比1∶15，g/mL)→调节pH值至9.5(1 mol/L NaOH)→连续搅拌120 min(50 ℃恒温)→离心30 min(4 000 r/min)→调节上清液pH值至4.8(1 mol/L HCl)→静置20 min→离心15 min(5 000 r/min)→沉淀洗至中性→冷冻干燥→玉米胚芽蛋白。

玉米胚芽蛋白→加入去离子水(控制一定底物浓度)→调节pH值(1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl)→加酶→90 ℃灭酶(10 min)→冷冻离心20 min(10 000 r/min)→收集上清液→冷冻干燥。

1.3.3 酶解产物水解度的测定

水解度(DH)的测定采用茚三酮比色法[12]。

1.3.4 ACE抑制率的测定

采用FAPGG法体外测定ACE抑制率[13]。

1.3.5 单因素试验

不同蛋白酶对玉米胚芽蛋白的酶解工艺参数如表1所示。以酶解产物水解度和ACE抑制率为考察指标，确定后续试验用酶。在此基础上，考察pH值(5、6、7、8、9)、底物浓度(1%、3%、5%、7%、9%)、加酶量(2 000、4 000、8 000、12 000、16 000 U/g)和温度(30、40、45、50、60 ℃)对酶解产物DH和ACE抑制率的影响。

表1 不同蛋白酶的酶解工艺参数Table 1 Parameters of enzymatic hydrolysis of different proteases

1.3.6 响应面试验设计

根据单因素试验结果，选择pH值(X1)、加酶量(X2)、温度(X3)为优化变量，以酶解产物ACE抑制率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计，进行三因素三水平的响应面试验，确定酶解玉米胚芽蛋白的最优工艺条件。响应面因素与水平设计见表2。

表2 响应面因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.4 数据处理

所有试验均重复测定3次。采用Design Expert 8.0.6进行响应面试验设计、结果分析及预测。采用SPSS Statistics 21.0对数据进行显著性差异分析(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 不同蛋白酶对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响

由于不同蛋白酶作用底物的结合位点及水解方式不同，其酶解片段的结构与活性亦不相同，因此，选取合适的蛋白酶是制备目标肽的重要因素[14]。由图1可知，不同蛋白酶的水解效果差异显著，水解度由高到低依次为风味蛋白酶>碱性蛋白酶>胃蛋白酶>木瓜蛋白酶；风味酶酶解产物的ACE抑制率最高，明显高于其他蛋白酶。说明玉米胚芽蛋白结构更适宜风味酶发挥作用，能够有效释放更多目标肽段。随着时间的延长，水解产物的水解度和ACE抑制率呈现不断增高后趋于平缓的趋势。因此选择风味酶为后续试验用酶，且控制酶解时间为120 min。

图1 不同蛋白酶对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响Fig.1 Effects of different proteases on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

2.1.2 pH值对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响

由图2可知，随着pH值的不断增加，水解度和ACE抑制率呈现先增大后下降的趋势。在pH 6时，水解度和ACE抑制率均达到最大值，当继续增大pH值，水解度和ACE抑制率均不断降低。这可能是因为pH值超出一定范围影响了蛋白酶的稳定性，同时底物与蛋白酶的电荷分布发生变化，降低了酶与底物的结合能力，进而影响酶解进程。因此，可初步确定风味酶最佳酶解为pH 6。

2.1.3 底物浓度对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响

由图3可知，随着底物浓度的不断增大，水解度和ACE抑制率总体呈现先升高后降低的趋势，当底物浓度为3%时，二者均达到最高值，分别为(28.17±0.44)%和(56.11±2.07)%。原因可能是当底物浓度超出最适范围，酶解液中溶质的流动性变差，使反应过程中蛋白酶的扩散作用降低，从而导致了水解反应的速率降低。因此，较为合适的底物浓度为3%。

图2 pH值对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响Fig.2 Effect of pH value on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

图3 底物浓度对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

2.1.4 加酶量对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响

图4 加酶量对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

如图4可知，水解度和ACE抑制率随着加酶量的增加呈现快速升高的趋势。这是由于加酶量的增加提供了更多反应位点，提高了酶的作用效率，释放了更多的活性肽段。当加酶量超过一定值，ACE抑制率反而下降。原因是水解反应过度，使原本具有活性的多肽活性丧失，生成较多游离的氨基酸。因此，加酶量要控制适当，较为合适的加酶量为12 000 U/g。

2.1.5 温度对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响

由图5可知，水解度和ACE抑制率随着温度的升高呈现先升高后降低的趋势。当酶解温度为45 ℃时，ACE抑制率达到最高值(65.73±0.21)%，但继续升高温度，ACE抑制率快速下降。说明蛋白酶对温度的变化较为敏感，温度过低不利于反应的充分发生，而温度过高则会引起酶部分失活。因此，选择酶解温度为45 ℃。

图5 温度对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度及ACE抑制率的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

2.2 响应面试验

根据单因素试验的结果，选取风味蛋白酶酶解玉米胚芽蛋白，固定底物浓度为3%，酶解时间为120 min，根据响应面法的Box-Benhnken原理，选取pH值、加酶量和温度进行优化试验，试验结果见表3，方差分析见表4。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Response surface experiment design and results

表4 回归模型及方差分析Table 4 Regression model and variance analysis

利用Design Expert 8.0.6软件对数据进行逐步回归分析，得到各因素拟合后的二次多项回归方程：Y=68.67-13.21X1+5.71X2-5.96X3+2.73X1X3-3.5X12-8.62X22-4.53X32。由表4可知，回归模型极显著(P<0.000 1)，R2=0.986 4，说明该模型置信度高，ACE抑制率与各因素之间线性关系显著。因此，可通过上述方程确定此酶解工艺的最优参数。此外，通过F检验值可知3个因素对ACE抑制率的影响大小依次为X1(pH值)>X3(温度)>X2(加酶量)。图6是加酶量为零水平(12 000 U/g)时，pH值和温度的响应面图。当加酶量确定时，pH值与温度的交互作用对ACE抑制率影响显著，而pH值和加酶量、加酶量和温度的交互作用对ACE抑制率影响不显著。

图6 pH值和温度的交互作用对玉米胚芽蛋白酶解产物ACE抑制率的响应曲面Fig.6 Response surface diagram of the interaction of various factors on ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

通过 Design-Expert 8.0.6软件分析及预测，得到最优酶解工艺参数：pH 6，温度40 ℃，加酶量13 300 U/g。采用此最优工艺进行验证，将酶解参数设定为底物浓度3%、酶解时间120 min、pH 6，温度40 ℃，加酶量13 300 U/g，酶解产物的实际ACE抑制率为(85.64±0.98)%，接近预测值83.49%，说明该回归模型对试验结果的分析预测较为准确。

3 结论

本研究通过不同蛋白酶对玉米胚芽蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的比较，发现风味蛋白酶酶解产物的ACE抑制率最高，通过单因素和响应面优化试验，得到影响ACE抑制率的3个因素由主到次依次为pH值、温度和加酶量，确定最优酶解工艺条件：底物浓度3%，酶解时间120 min，pH 6，温度40 ℃，加酶量13 300 U/g，此时ACE抑制率为(85.64±0.98)%，与预测值吻合。玉米胚芽蛋白酶解产物具有显著的ACE抑制活性，可为降血压药物及相关功能性食品等诸多领域的开发提供理论依据。