基于天然皂皮皂苷界面自组装包埋制备粉末鱼油及其特性研究

陈小威，尹文俊，李金玉，杨晓泉，马传国

1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2.华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州 510640

近年来，含ω-3长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的功能性食品在世界食品市场上引起广泛关注。鱼油作为ω-3长链多不饱和脂肪酸(如DHA和EPA)的重要来源,鱼油及其产品得到了快速发展。大量研究表明，ω-3鱼油在促进人体健康方面发挥着积极的作用，如提高大脑认知能力、降低炎症因子的生成、降低心血管疾病发病率、改善视力、防止癌症恶化、维持骨密度以及预防肥胖病和糖尿病[1]。然而，鱼油因高不饱和脂肪酸的存在易发生氧化。微胶囊粉末化不仅可以延缓鱼油的氧化，而且有利于其保存、运输和使用[2]。油脂经过乳化包埋后亚微米粒径的形成可显著提高生物利用率，更适合婴幼儿、老人等消化能力较弱的人群进行营养补充[3-5]。

目前，用于鱼油的粉末化加工方法主要有凝胶化、冷冻干燥和喷雾干燥等[6-8]。喷雾干燥是用于油和油溶性活性物质微胶囊化的最方便、最经济的技术，具有成本低廉、操作简单、干燥时间短的特点，有利于热敏物质(如鱼油)的保护[9]。Yesilsu等[10]发现并证实，喷雾干燥粉末化技术能有效减缓鱼油氧化并减少不良味道和风味的产生。而壁材的性质和组成决定着对芯材的包埋效果，是微胶囊化过程中重要的影响因素。皂皮皂苷(QS)由疏水性的五环三萜皂苷配基和两个亲水性的糖体3部分构成，常作为一种天然非离子型表面活性剂，具有很强的乳化能力。Hanan等[11]用QS对鱼油进行乳化封装，发现相对于传统乳化剂(如卵磷脂、Tween-80、辛烯基琥珀酸淀粉钠等)，QS不仅能提供稳定的乳化体系，还具有减缓油脂氧化方面的潜在优势。作者利用天然双亲性小分子QS对鱼油进行乳化制成乳液，并与传统的乳化剂(酪蛋白酸钠)作对比，将乳液经喷雾干燥后制成粉末鱼油。通过对粉末鱼油的外观形貌、微结构、包埋率、氧化稳定性、复溶性和不同环境(pH值、盐浓度和温度)胁迫下的稳定性进行研究，探究QS在鱼油粉末化的应用性能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼油(OMAX 1812)：诺亚圣有限公司；皂皮皂苷(Q-NATURALE 200)：宜瑞安食品配料有限公司；酪蛋白酸钠(SC，纯度>90.0%)：新西兰Fonterra有限公司；甲醇、氯仿、异辛烷和异丙醇(分析纯)：天津科密欧试剂公司。

1.2 仪器与设备

Nano-ZS Zeta电位及纳米粒度分析仪：英国马尔文公司；B-290喷雾干燥器：瑞士BUCHI公司；7890 A-5975C气质联用仪：美国Agilent公司；T25数显型分散机：艾卡(广州)仪器设备有限公司；M-110EH30高压微射流均质机：美国Microfluidics International Corporation公司；1530VP场发射扫描电镜：德国LEO公司。

1.3 方法

1.3.1 粉末鱼油的制备

乳液的制备：将QS加入去离子水中配制成不同浓度的QS溶液，搅拌使其完全分散溶解，备用；将鱼油加入备用的QS溶液中，6 000 r/min高速搅拌剪切3 min，然后在80 MPa下高压微射流3次循环乳化处理，得到鱼油乳液。

粉末鱼油的制备：通过喷雾干燥技术制备粉末油脂，喷雾干燥的进风温度为140 ℃，通过进样流速控制出风温度为70 ℃。

1.3.2 乳液粒径与电位的测定

将原乳液按照一定比例稀释，采用Nano-ZS纳米粒度电位仪测定粒径分布及Zeta电位。水相和油相的折射率分别为1.763和1.330，测试温度为25 ℃。

1.3.3 微胶囊微结构的观察及流动性测定

采用GB/T 11986—1989测定粉末鱼油的休止角，表征产品流动性。利用扫描电子显微镜在15 kV加速电压下观察粉末鱼油微胶囊结构，在此之前对微胶囊粉末进行表面喷金。

1.3.4 包埋率的测定

包埋率的测定参考文献[12]。总油的提取：准确称取粉末油脂样品10 g，依次加入20 mL甲醇、50 mL 氯仿，在53 kHz、25 ℃条件下超声5 min，过滤后取滤液在45 ℃抽真空旋蒸至恒质量，得到总油质量m0(g)。

总油含量=(m0/10)×100%。

表面油的提取：精确称取质量M(1 ～2 g)的微胶囊产品，用30 mL乙醚准确浸提1 min后，立即抽滤，用20 mL乙醚洗涤滤渣，收集滤液，将滤液真空浓缩即得到表面油，其质量记作m(g)。

表面油含量=(m/M)×100%，

包埋率=(1-表面油含量/总油含量)×100%。

1.3.5 储藏氧化稳定性

准确称取0.100 g粉末鱼油于2 mL离心管中，加入1.5 mL异辛烷/异丙醇的混合液(体积比3∶1)后涡旋混合振荡20 s(5 次)；3 400 r/min 离心2 min，取上清液200 μL加入2.8 mL 甲醇/正丁醇混合液(体积比2∶1)中涡旋混合；向溶液中加入15 μL 3.94 mol/L的硫氰酸铵和15 μL的亚铁溶液(由0.132 mol/L的BaCl2和0.144 mol/L的Fe2SO4混合后以3 400 r/min离心2 min，取上清液)；涡旋混合后避光平衡20 min，利用紫外分光光度计在510 nm测定吸光度。以过氧化氢标准品的标准曲线计算油脂氧化产生的氢过氧化物量。

1.3.6 环境胁迫物理稳定性

温度胁迫：将25 mg粉末鱼油溶于装有10 mL去离子水的玻璃瓶中并密封，分别在25、60、80、100 ℃的水浴中处理30 min，静置24 h 后采用Zeta激光粒度分析仪测定粒径和电位。酸碱胁迫：将25 mg粉末鱼油溶于10 mL pH值为3、5、7、9、11的去离子水溶液中，静置24 h 后测定粒径和电位。离子强度胁迫：将25 mg粉末鱼油溶于10 mL浓度为100、200、300、400、500 mmol/L的NaCl水溶液中，静置24 h后测定粒径和电位。

2 结果与分析

2.1 皂皮皂苷在油-水界面的吸附与组装特性

在乳液构建和稳定方面，表面活性剂在油-水界面的吸附与组装特性起到决定性作用[13]。皂皮皂苷(QS)作为天然双亲性表面活性剂被证实拥有独特的油-水界面活性[14]。利用悬滴界面流变仪研究了QS在油-水界面的吸附动力学，如图1a所示。在初始阶段，界面张力随时间延长迅速下降，表明QS能快速扩散到界面上，这归功于QS的双亲分子特性(QS分子由一个疏水苷元和两个亲水性多糖侧链组成)。当吸附量达到饱和时，界面张力进一步降低并趋于稳定，这是由于QS在界面的吸附与重排降低了界面自由能和界面张力[14]。在悬滴法测量油-水界面张力时发现在液滴表面形成了起皱膜(如图1b箭头所示)，表明QS在油-水界面发生了某种特殊的重排，这与Golemanov等[15]的研究结果一致。这种界面褶皱现象也被称为表面凝胶化，而此凝胶化也被证实具有改善乳液稳定性的特性。此外，这种QS界面膜在偏光显微镜(PLM)下表现出双折射的网状纤维现象,如图1c所示，表明QS在油-水界面发生了分子间相互作用的有序组装重排而形成了纤维化网状界面膜。

图1 皂皮皂苷在油-水界面的动态吸附、组装行为及组装体的偏光形貌[16]Fig.1 Dynamic interfacial tension, droplet surface gelling behavior of a water droplet in oil phase and polarized light image of the interface assembly[16]

为了进一步证明纤维膜在乳液中的存在，用荧光标记(THT)结合激光共聚焦(CLSM)技术观察QS稳定的粗乳液。THT具有与纤维结构体特异性结合的作用，被广泛地应用于纤维体的表征[17]。从图2a可观察到强烈的荧光包围在油脂周围，表明QS自组装后形成纤维体结构包裹油滴。此外，还可知油滴周围形成的纤维状结构体层层排列，在油滴表面组装成多层界面壳(如箭头所示)，可能抑制乳液液滴间的聚集从而提高乳液的稳定性。这种现象在传统的乳化剂，如蛋白质、多糖、纤维素、卵磷脂、Tween-80和SDS等中没有表现。用PLM对乳液中油滴的微观结构进行观察，如图2b所示，也进一步证实了所有油滴显示出多孔网络微观结构，在偏振光下油滴周围显示出强烈的各向特异性偏光，这是典型的自组装特征[17]。这与图1c的结果一致，进一步证明了QS在油-水界面发生了有序纤维化自组装。这种界面自组装行为形成坚固的“外壳”，可能会增强乳液的稳定性以及抗外界干扰的能力，如喷雾干燥[16,18]。

图2 皂皮皂苷稳定粗乳液在激光共聚焦荧光和偏振光下的微观结构形貌[16]Fig.2 CLSM and PLM images of the crude emulsion stabilized by Quillaja saponin[16]

2.2 粉末鱼油的形成与微结构形貌

基于QS油-水界面组装在不同皂苷添加量下稳定制备了鱼油乳液，并利用喷雾干燥技术得到粉末鱼油，如图3a—图3c所示。粉末鱼油呈白色，存放在聚丙乙烯瓶中，于4 ℃冰箱中放置3个月,无黏稠或漏油迹象。相对于传统酪蛋白(SC)制备的粉末鱼油(图3d)，QS包埋的粉末鱼油具有较好的流动性，这从粉末鱼油的休止角也可以证实。表1为不同浓度QS和1.5%SC制备粉末鱼油的总油含量、表面油含量、包埋率和休止角，随着QS用量的增加，粉末鱼油的休止角从55.55°逐渐降低至45.10°，明显小于1.5% SC制备的粉末鱼油(61.80°)。为了进一步分析粉末鱼油的微结构，利用扫描电镜技术(SEM)对其形貌进行了表征。如图3e—图3h所示，所制备的粉末鱼油呈球形，没有明显的裂缝或裂纹，这有利于减少油泄露到颗粒表面并防止空气渗透到胶囊中，从而防止密封的鱼油氧化[8]。然而，在颗粒的表面出现明显的凹痕，这可能是喷雾干燥技术制备微胶囊所特有的，即在干燥过程的早期，传质不均匀导致颗粒迅速收缩造成，这在其他研究中也有报道[19-20]。但从SEM图像上可看出，SC制备的粉末鱼油部分已经聚集成团，这可能是因为其较高的表面油含量(23.83%±0.39%)和较低的包埋率(71.52%±0.53%)，从而促使SC粉末鱼油颗粒间相互黏附，这也解释了SC制备的粉末鱼油休止角较大的原因。

相对于SC包封得到的粉末鱼油，QS稳定制备的粉末鱼油具有较高的包埋率，如表1所示。理论上，作为生物大分子的蛋白质在界面的双亲稳定性和分子缠绕更有利于内部油脂的包封，如大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白和辛烯基琥珀酸淀粉常用于微胶囊的壁材[21]。QS粉末鱼油表现出更好的包埋率，可能归因于QS在油-水界面自组装形成了多层纤维化的网络膜(图1)。此外，随着QS使用量的增加，鱼油的包埋率逐渐从88.80%升高到90.24%，这高于传统乳化剂制备鱼油的包埋率[22]。同时，相对于SC包封剂得到的粉末鱼油，QS稳定制备的粉末鱼油具有更低的表面油含量，且随着QS使用量的增加，鱼油的表面油含量逐渐降低，这也可解释粉末鱼油在外观和流动性上的差异。QS在鱼油包埋上的良好特性可为芯材提供更好的保护作用，减缓鱼油的氧化。

注:a、e为1.0% QS; b、 f为1.5% QS; c、 g为2.0% QS；d、h为 1.5%SC。图3 不同浓度QS和1.5% SC制备粉末鱼油的外观及微观样貌Fig.3 Appearance and SEM of fish oil powders prepared with varying QS concentration and 1.5% SC

2.3 粉末鱼油的氧化稳定性

为了考察粉末鱼油的氧化稳定性，通过进行加速诱导储藏条件(60 ℃)评价粉末鱼油的过氧化值。由图4可知，过氧化值随着诱导时间的延长逐渐升高，说明鱼油发生快速氧化。相对于未包封的鱼油，粉末化鱼油的氧化速率明显较低。相对于SC稳定的粉末鱼油，QS制备的粉末鱼油氧化更慢，且随着QS浓度的增加这种效果更为明显，这可能是由于QS稳定的粉末鱼油表面油含量低(表1)，降低了鱼油与空气的接触氧化。此外，也有文献报道皂皮皂苷提取物中微量多酚的存在也可抑制油脂的氧化[23]。

2.4 粉末鱼油的复溶重构特性

粉末油脂的复溶重构特性对其应用具有重要的影响。通过对比粉末鱼油的乳液前体和复溶液的粒径、多分散系数(PDI)和电位，考察了粉末鱼油的复溶重构特性。从表2可知，QS制备的粉末鱼油在复溶后粒径与相应新制乳液的粒径接近，电位有所增加，说明以QS乳液喷雾干燥制成的粉末鱼油在一定程度具有很好的稳定性。然而，SC粉末鱼油复溶液的粒径相较于新制备乳液显著增加，表明其复溶性较差，这可能归因于表面含油量高和大分子乳化剂弱复溶引起的乳滴聚集而表现出差的重构特性，这从复溶后的粒径分布也可得到证实。如图5所示，SC粉末鱼油液中存在大的聚集体。QS稳定粉末鱼油的复溶液中粒径呈单分散分布，具有较好的分散性，且随着QS浓度的增加粒径更小，单分散性也更好，表明QS稳定制备的粉末鱼油具有良好的复溶重构性。

图4 不同浓度QS和1.5%SC制备粉末鱼油的过氧化值随诱导时间的变化Fig.4 The POV of fish oil and fish oil powder prepared with varying QS concentration and 1.5% SC

表2 粉末鱼油乳液前体(新制备乳液)和复溶液的粒径、分散性及电位特性Table 2 Particle size, dispersion and potential of powdered fish oil reconstituted emulsion and their precursors (fresh emulsion)

图5 不同浓度QS和1.5% SC制备粉末鱼油复溶液的粒度分布Fig.5 Particle size distribution of reconstituted emulsions of fish oil powder prepared with varying QS concentration and 1.5% SC

2.5 粉末鱼油在环境胁迫下的物理稳定性

不同食品体系具有不同的酸碱度，液态食品体系还会存在着一定的电解质，并且在大多数食品加工过程中，温度处理是不可缺少的工序。因此，pH值、盐浓度和温度是粉末鱼油在应用和加工中的重要因素，也是粉末鱼油在食品体系中能维持稳定状态的基本保障。从图6a和图6b可知，在不同pH值条件下，SC粉末鱼油的粒径和电位变化较大，说明SC制备的粉末鱼油在酸碱条件下较为敏感。当pH值为4时，SC粉末鱼油在水中粒径很大且带少量正电荷，这可能是因为SC是蛋白质类的乳化剂，在等电点时乳滴在溶液中的静电斥力降低，发生乳滴间的碰撞、凝聚而产生沉淀，这限制了粉末鱼油的应用[24]。对于非离子表面活性剂QS稳定的粉末鱼油复溶液在极端pH值(如pH 3、pH 11)下粒径保持基本不变，说明其具有高的酸碱稳定性。

注：a、b为pH值； c、d为盐离子浓度； e、f为温度。图6 不同浓度QS和1.5%SC稳定的粉末鱼油复溶液在不同pH值、盐离子浓度和温度下的粒径和电位变化Fig.6 Particle size and Zeta potential of reconstituted emulsions of fish oil powder at different pH, ionic concentration, and temperature

通过考察不同NaCl浓度对粉末鱼油复溶液的粒径和电位变化探究了不同盐离子浓度下的粉末鱼油复溶液的稳定性。由图6c和图6d可知，随着离子强度的增加，Zeta电位绝对值均迅速降低，而后趋于平缓，这可能是因为当离子强度增大后，盐离子会迅速争夺溶液中大部分的自由水，使静电屏蔽逐渐减弱[25]。尽管盐离子削弱了静电排斥，使得Zeta电位升高，但是QS粉末鱼油复溶液的粒径保持不变，表明即使在500 mmol/L(约3.025%)NaCl环境下仍具有较高的稳定性。然而，在蛋白稳定的体系中，离子强度影响蛋白质的电离状态以及蛋白质空间结构。随着离子强度增加，破坏蛋白质的水化作用，引起蛋白质溶解度降低，静电屏蔽效果慢慢接近极限，最终会导致“盐析”现象出现，使得SC粉末鱼油复溶液的粒度逐渐增大[26-27]。

温度处理是食品加工(如灭菌)过程中最为常见的工序。将粉末鱼油复溶液放置不同温度下进行30 min的热处理，考察不同温度下的物理稳定性。从图6e和图6f可知，SC稳定的粉末鱼油复溶液对温度极为敏感(出现聚集)，而 QS 稳定的粉末鱼油在25～100 ℃热处理下无显著的粒径变化。这是因为大分子SC在高温处理下会发生分子变性，蛋白分子结构会发生解析，导致乳液体系不稳定[26,28]。而QS作为天然小分子对温度不敏感，使得 QS 为乳化剂制备粉末鱼油的复溶液带有高程度负电荷，互相排斥不会产生聚沉现象，并且由于纳米乳粒径较小，受到重力作用较弱，布朗运动下可以使其平衡，具有较好的稳定性[29]。

3 结论

本研究基于天然皂皮皂苷(QS)在油-水界面独特的纤维化自组装特性，在乳液油滴表面形成多层纤维膜，促进鱼油的粉末结构化。研究表明，相较于传统酪蛋白喷雾干燥制备的粉末鱼油，QS稳定的粉末鱼油具有较高的包埋效率(高达90.24%)，能显著抑制鱼油在储存过程中的氧化。同时，小分子皂皮皂苷制备的粉末鱼油还表现出更好的复溶重构特性以及极端环境(极端pH值、高离子强度、高温)下的稳定性。这一研究将为新资源食品添加剂皂皮皂苷和粉末鱼油扩宽应用范围，并为油脂粉末结构化提供了可行性解决方案。