外周血白细胞分化抗原195、雌二醇水平与桥本甲状腺炎相关性研究*

程永红,韩 梅,贾晓斌,刘 苗,刘 懿

1.陕西省商洛市中心医院(商洛726000)；2.陕西省咸阳市泾阳县医院检验科(咸阳713700); 3.西安交通大学第一附属医院检验科(西安710061)

桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)是临床常见的自身免疫性疾病,其中女性呈现较高的发病率[1]。HT的发病机制目前尚不十分明确,目前的研究认为遗传因素、环境因素以及免疫因素等的协同作用诱导了HT的发生[2]。研究证实HT与雌二醇之间存在明显的相关性[3-4]。另外,白细胞分化抗原195(Cluster of differentiation 195,CD195)也被认为可能参与甲状腺免疫活性紊乱的病理过程[5]。本研究通过分析HT患者血液雌二醇和 CD195与HT 的相关性,进而探讨两指标水平的变化对HT患者甲状腺功能的影响。

资料与方法

1 一般资料 本研究选择2018年3月至 2020年 3月期间80例于西安交通大学第一附属医院、陕西省商洛市中心医院及陕西省咸阳市泾阳县医院就诊的女性HT患者作为研究对象，依据HT患者的甲功检查结果分为甲功正常组和甲功减退(甲减)组。正常组包括39例患者,平均年龄(50.79±5.23)岁,病程(3.16±2.96)年。甲减组包括41例患者,平均年龄(49.72±5.60)岁,病程(3.03±3.12)年。HT的诊断基于临床、实验室和影像学检查结果[6]:血清甲状腺球蛋白抗体和(或)甲状腺过氧化物酶抗体(Thyroid peroxidase antibody,TPO-Ab)阳性；甲状腺超声检查显示甲状腺弥散肿大。对照组选择36例同期体检健康人群，对照组纳入标准：既往无其他自身免疫性疾病和其他内脏器官恶性肿瘤。各组研究对象的年龄及病程比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已获得西安交通大学第一附属医院、陕西省商洛市中心医院及陕西省咸阳市泾阳县医院医学伦理委员会批准,并得到所有研究对象的知情同意。

2 试剂和仪器 采用电化学发光免疫分析法测定血清雌二醇，游离三碘甲状腺原氨酸(FT3),游离甲状腺素(FT4),促甲状腺激素(TSH)及甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)水平，仪器和试剂分别使用美国贝克曼库尔特Uni Cel DxI 800全自动免疫分析仪及其配套试剂盒。CD195阳性细胞百分比检测应用直接免疫荧光技术，仪器采用美国BD公司的FACS Scan 流式细胞仪。人外周血淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司。RPMI1640细胞培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD195抗体购自深圳晶美生物工程有限公司，甲状腺超声检查采用 Phlip IU22彩色超声诊断仪。

3 研究方法

3.1 血样采集：所有静脉血样在研究对象夜间禁食>8 h后的早晨(7:00～9:00)采集,共采集10 ml血液,分成两管各5 ml,将一管血液样本以 3000 r/min 离心后分离血清,进行雌二醇,TSH、FT3、FT4和TPO-Ab水平检测或在-20 ℃下保存待用。另一管血液加入肝素抗凝用于检测CD195阳性细胞百分比。

3.2 血液CD195阳性细胞百分比检测：将肝素抗凝血液与磷酸盐缓冲液以1∶1比例混合后置入圆底离心管中，并加入等体积的淋巴细胞分离液，以2000 r/min的速度离心15 min，然后收集有核细胞层，采用 Hank’s 液洗涤3次，每次以1500 r/min离心5 min。将洗涤后的细胞置入RPMI1640培养液中，调节细胞浓度为1×106/ml，再加入PHA ，调节质量浓度为100 μg/ml，放置于CO2培养箱孵箱48 h，要求稳定的温度(37 ℃)和稳定的CO2水平(5%),然后收集CD195细胞，采用磷酸盐缓冲液进行洗涤重悬，加入异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD195，以不加抗体的标本作为阴性对照。 吹吸混匀后置于4 ℃孵育45 min，采用磷酸盐缓冲液洗涤2次，残留液体吸尽，沉淀弹散后在各管中加入1% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液400 μl固定，于4℃保存，12 h 内应用 FACS Scan 流式细胞仪检测CD195阳性细胞百分比。

3.3 甲状腺超声检查：所有研究对象均行甲状腺超声检查，由2名有4年甲状腺超声检查经验的医师进行操作,使用高分辨率超声波扫描仪,使用10 MHz线性探头,测量甲状腺的峡部厚径。

结 果

1 各组甲状腺功能及超声检查结果比较 HT患者甲状腺呈现不同程度的肿大。与对照组比较，甲减组和正常组的峡部厚径明显增大,其中甲减组增大更显著(P<0.01)。与对照组和正常组比较,甲减组血清FT3和FT4水平明显降低,而TPO-Ab和TSH水平则明显增高(P<0.01)。与对照组比较,正常组的TPO-Ab水平明显增高(P<0.01),而TSH,FT3和FT4水平比较则无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组甲状腺功能和超声检查结果比较

2 各组外周血雌二醇水平及CD195阳性细胞百分比比较 与对照组比较,甲减组和正常组的雌二醇水平和CD195阳性细胞百分比均明显增高(P<0.01),甲减组的两指标与正常组比较明显增高(P<0.01),见表2。

表2 各组外周血雌二醇及CD195水平比较

3 相关性分析 甲减组和正常组的雌二醇水平和CD195阳性细胞百分比呈正相关性(r=0.823,P<0.01)。甲减组雌激素水平和CD195阳性细胞百分比分别与TSH,TPO-Ab及峡部厚径呈正相关性,而与FT3和FT4水平呈负相关性[r(雌二醇)=0.838,0.810,0.817,-0.799,-0.803,均P<0.01;r(CD195)=0.824,0.809,0.782,-0.804,-0.829,均P<0.01]。正常组的雌激素水平和CD195阳性细胞百分比分别与TSH,TPO-Ab水平及峡部厚径有正相关性[r(雌二醇)=0.786,0.821,0.808,均P<0.01;r(CD195)=0.771,0.789,0.802,均P<0.01]。

讨 论

HT是自身免疫性甲状腺疾病中最常见的一种，发病率高达5%，发病人群主要是育龄妇女。HT患者甲状腺肿大，甲状腺内单核细胞明显浸润，血清抗甲状腺自身抗体浓度升高，包括抗甲状腺球蛋白抗体和TPO-Ab，是导致甲状腺功能减退的最常见的潜在因素[6-7]。本研究的结果则印证了上述文献的观点，其中甲减组TPO-Ab水平增高更显著，该组患者的甲状腺肿大更明显。研究指出,甲状腺局部的T淋巴细胞免疫功能紊乱诱导了HT的发生，CD4+T淋巴细胞分泌的Th1/Th2 细胞的比例失衡是导致桥本甲状腺炎发病的重要机制之一。在桥本甲状腺炎的发病过程中Th1细胞的表达明显占优势[8]。Th1 细胞分泌IL-2，IFN-γ和TNF-α 等细胞因子。这些细胞因子诱导B细胞分化并分泌过量自身抗体，同时趋化大量T淋巴细胞和单核细胞进入甲状腺细胞内发挥细胞毒性作用，最终导致甲状腺细胞的损伤[9]。CD195是CD4+T淋巴细胞特异性的表面因子。单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞中均发现有CD195表达。研究发现CD195是Th1细胞的优势细胞因子[10]。CD195的过度表达诱导Th1细胞的细胞毒作用导致甲状腺细胞损伤,是引起HT患者甲状腺功能减退的主要原因[11]。李存杰等[12]的研究发现HT患者经过治疗后CD195及TPOAb水平明显下降。袁晓岚等[10]的研究认为HT患者外周血液的CD195阳性细胞百分比明显高于对照组。经过治疗后甲减组和甲功能正常组CD195阳性细胞百分比显著降低。他们进一步地研究认为CD195与TSH及TPOAb有明显相关性。本研究结果与上述文献的观点相符。提示CD195可能参与HT细胞免疫紊乱的病理过程,其异常表达可能诱导了HT的发生。

目前，自身免疫性疾病的发病率呈上升趋势，其影响着5%～8%的人口[13]。研究表明女性最容易发生自身免疫性疾病,其对该疾病具有较高的细胞免疫敏感性。近年来的研究发现雌激素参与了人体的免疫调节机制，从而有可能影响到甲状腺的功能，并与 HT 的发生及发展有一定的相关性[14]。雌激素属于类固醇激素,其生物学作用主要通过调控核内雌激素受体完成。人体多个组织器官中都被发现有雌激素受体表达,包括女性生殖器官乳腺和子宫以及肾脏、骨骼和男性生殖器官等[15]。文献报道甲状腺组织细胞中也存在雌激素受体表达[16]。雌激素通过作用于T细胞上的雌激素受体促进T细胞的增殖和活化以及细胞因子的释放，并导致Th1/Th2的比例失衡，进一步引起T细胞功能的紊乱，并激活B细胞产生更多的自身抗体，进而诱导HT的发生[17]。研究发现HT患者甲状腺细胞中的雌激素受体阳性率明显高于对照组[18]。另外，围绝经期HT患者体内雌二醇水平也被发现明显增高[14]。提示雌激素水平的变化与HT的发生存在相关性。本研究对HT患者的分析与上述文献的结论相符。提示雌激素可能与HT患者的免疫功能紊乱有关,雌二醇水平的变化可能影响着HT的发生和发展。然而雌激素与HT相关性的深层机制有待进一步研究，同时需要更多的样本量进行分析印证。

本研究相关性分析的结果显示甲减组和正常组的雌二醇水平和CD195阳性细胞百分比有正相关性。甲减组的雌二醇水平和CD195阳性细胞百分比分别与TSH、TPO-Ab、FT3和FT4水平有显著相关性。目前,彩色多普勒超声检查广泛应用于HT疾病的诊治中,其可提高HT诊断的敏感性和特异性[19]。本研究结果显示HT患者的峡部厚径明显增大,其中甲减组增大更显著。进一步地分析显示甲减组的雌二醇水平和CD195阳性细胞百分比分别与甲状腺峡部厚径有正相关性,推测雌二醇和CD195可能与HT患者甲状腺局部的免疫紊乱有关，其异常的表达可能诱导了HT的发生。