基于数据挖掘的国家名老中医抗肿瘤用药规律及核心复方解析

谢丹枫 王能 陈紫莹

摘要 目的：基于数据挖掘和网络药理学研究国家名老中医抗肿瘤方剂的用药规律、核心处方及药物靶标，探讨核心处方防治肿瘤的机制。方法：收集国家名老中医抗肿瘤方剂，采用中医传承辅助平台（TCMISSV 2.5）分析用药规律及挖掘核心复方，通过网络药理学预测核心复方靶点，并使用GO分析和KEGG分析探索核心复方抗肿瘤的机制。结果：本研究收集方剂296条，中药383味。统计高频药物、药物组合及计算出10种核心药物。在核心药物的基础上按照君臣佐使配伍规律确定核心复方“白花蛇舌草-黄芪-莪术-甘草”。对核心复方运用网络药理学共筛得118种化合物、95个药物活性成分及52个核心靶点。KEGG通路分析主要与炎性反应、凋亡及免疫等生物学过程相关，与前期抗肿瘤活性研究数据相符。结论：名老中医治疗肿瘤多以扶正祛邪、攻补兼施为治则，核心复方的挖掘为中医药抗肿瘤治疗标准化、现代化和国际化提供新思路。网络药理学结果提示核心复方的抗肿瘤机制主要包括促进细胞凋亡，调控免疫平衡，抑制缺氧和炎性微环境，阻断肿瘤新生血管形成。

关键词 名医经验;恶性肿瘤;数据挖掘;网络药理学;中医药

Abstract Objective：To explore the medication rules of famous national traditional Chinese medicine（TCM）masters for cancer treatment，and to determine the core formula and cancer prevention mechanism based on data mining and network pharmacology.Methods：The formulas for anti-cancer of national TCM masters were collected.TCMISSV 2.5 software was adopted for the analysis of prescription rules and core formula.We predicted the core compound target through network pharmacology，and used GO analysis and KEGG analysis to explore the anti-tumor mechanism of the core compound.Results：A total of 296 formulas and 383 kinds of Chinese medicines were collected.We counted the high frequency medicines，medicine pairs and calculated 10 critical medicines.A core formula consisting of Oldenlandia Diffusa，Astragali Radix，Curcumae Rhizoma and Glycyrrhizae Radix was found according to monarch，minister compatibility rule principle.The core formula was used by network pharmacology to screen 118 kinds of compounds，95 medicianl active components and 52 molecular targets.KEGG pathway analysis was mainly related to biological processes such as inflammation，apoptosis and immunity，which is consistent with the data of previous anti-tumor activity research.Conclusion：The main principle of cancer-related prescriptions by famous national TCM masters is focused on strengthening healthy qi to eliminate pathogens，both reinforcement and supplementation.The discovery of the core formula provides a new idea for the standardization，modernization and internationalization of TCM anti-cancer therapy.Network pharmacology results indicates that the anti-cancer mechanisms of the core formula mainly focus on apoptosis induction，immune balance regulation，hypoxia and inflammation inhibition，as well as neoangiogenesis inhibition.

Keywords Traditional Chinese medicine master experience; Malignant cancer; Data mining; Network pharmacology; Traditional Chinese medicine

中圖分类号：R242文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.010

恶性肿瘤是威胁世界人民健康和生命的重大病种，2018年全球约有1 800万新发肿瘤患者和960万肿瘤死亡人数，2019年我国国家癌症中心最新统计数据显示恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91%，且发病率保持每年约3.9%的增长，死亡率每年保持约2.5%的增长，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2 200亿，防控形势及其严峻[1]。目前恶性肿瘤的主要治疗方式仍然是以“杀死性”治疗策略为主的对抗方式，耐药转移是导致其治疗失败的主要原因。随着“带瘤生存，重视生命质量的改善”等治疗理念的深入，中医药在肿瘤治疗中的作用和地位愈加重要，大量临床和基础研究证实中医药可以渗透到肿瘤治疗的各个环节，在此过程中众多国家名老中医提出多种治则，如扶正培本法、清热解毒法、活血祛瘀法、软坚散结法、消肿止痛法，并积累了诸多经方验方，在临床上发挥了良好疗效。然而正是由于理法方药流派众多，组成复杂，大规模的临床研究和机制探讨很难进行，造成中医药抗肿瘤的有效性和安全性在国际上认可度较低，所以总结国家名老中医用药规律，发现核心复方是中医药进行标准化、现代化和国际化的必要步骤。本研究运用数据挖掘与网络药理学的研究方法，以历代国家名老中医经验方为参考，旨在溯源分析中医药抗肿瘤复方的配伍规律及用药思路的科学性，挖掘核心复方，并初步探索可能的分子机制。

1 资料与方法

1.1 处方来源 本研究以国家级名老中医专科专病丛书《肿瘤病名中医良方验案》[2]及《国家级名老中医肿瘤病验案良方》[3]为处方遴选来源。

1.2 纳入标准 纳入中医药内服汤剂治疗肿瘤的古籍经方、名老中医经验方及病例报告。需明确记载有药物的组成及用量，疗效确切;有复诊的方剂只取首次处方;有中药加减的方剂只取基础方。

1.3 排除标准 排除外用中药、注射液等非内服汤剂治疗的方剂;排除中药剂量不明确的方剂;不同肿瘤所用方剂相同者，只录入一次

1.4 药名规范 参考《中华人民共和国药典》[4]，统一规范所录入的中药名称。比如“蚤休”“七叶一枝花”统一为“重楼”;“沙参”统一为“南沙参”;“云苓”“茯神”统一为“茯苓”。

1.5 数据的规范与数据库的建立

采用中国中医科学院中药研究提供的中医传承辅助系统（Traditional Chinese Medicine Inheritance Support System，TCMISS）软件V2.5版，将筛选并规范后的296首处方及383味中药录入“方剂管理”模块，采用双人复核录入的方法以确保数据录入无误，并使用“数据分析”模块中的“方剂分析”功能，进行组方规律的统计分析。

1.6 处方数据分析

频次统计分析：对每首方剂中每味中药的用药频次从大到小排序。同时统计XX味药物的四气（寒、凉、温、热、平）、五味（酸、苦、甘、辛、咸、淡）、归经（肝、心、脾、肺、肾、胆、小肠、胃、大肠、膀胱、三焦及心包经）属性，最后分别将结果导出。基于关联规则的组方规律分析：“支持度”指将前项与后项在一个数据集中同时出现的频率，“置信度”指前项出现时后项出现的概率。将“支持度个数”设置为26，“置信度”设置为0.55，基于关联规则将药物组合分别按频次与置信度由高到低进行排序，点击“规则分析”并导出结果，并导出核心药物网络关系图。

1.7 活性化学成分的收集

本研究使用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分别检索并收集核心单味药的化学成分信息。TCMSP可提供每种化合物的药代动力学信息，例如药物相似性（Drug-likeness，DL）和口服生物利用度（Oral Availability，OB）等。OB和DL是评估ADME（Absorption and Distribution and Metabolism and Excretion）吸收、分布、代谢、特性的重要指标[5]。OB≥30%可以反映其中药成分被吸收进入人体循环的速度与程度较高，DL≥0.18的化学成分与已知药物的相似性较高，作为药物主要活性成分的可能性较大。因此以OB≥30%且DL≥0.18为标准来收集癌毒清中具有良好ADME特性的活性化学成分。然后利用TCMSP系统药物靶向预测模型确定核心复方的潜在靶点，建立“化合物-靶点”模型图。

1.8 潜在作用靶点的预测

把从TCMSP数据库中检索所得的核心用药的活性化学成分蛋白质靶标输入UniProt（https：//www.uniprot.org/），使用UniProt KB检索功能，将物种设定为人类，提取相应的官方基因名称。在Gene Cards数据库（https：//www.genecards.org/）中检索肿瘤的的相关靶点，筛选关键词设置为tumor，收集肿瘤相关发病机制基因。对肿瘤相关发病机制基因与药物活性化合物靶点基因进行映射并筛选出共同靶点，由此预测核心复方治疗肿瘤的潜在作用靶点。

1.9 PPI网络的构建及拓扑分析

把潜在作用靶点基因输入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl），得到扩展的蛋白互作（Protein-protein Interaction，PPI）网络数据，下载PPI网络交互信息表。“Degree”为某节点在网络图中的链接数，可以反映节点之间的交互信息。利用Cytoscape V3.7.1中的网络拓扑分析插件CytoNCA以自由度degree>50（所有节点自由度中位数的2倍）筛选关键节点，获得核心复方作用于肿瘤的核心基因。

1.10 靶点通路注释分析

用David 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）和KOBAS 3.0数据库（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php）對核心复方作用于肿瘤的核心基因进行GO（Gene ontology）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析。GO富集分析指在某一功能层次上统计蛋白或者基因的数目或组成的一个有向无环图，包括3个分支：生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和细胞组分（Cellular Component，CC）。KEGG分析可以用于推断蛋白质之间的新关联，从而丰富蛋白质的生物学功能。设定以人类基因为范围，以P<0.05为筛选值，可获得相应的数据。选择具有最多相应目标点数量的相关生物过程或相关途径，绘制条形图展示GO分析结果，并选择气泡图呈现KEGG通路分析。

1.11 “化合物-靶点-通路”（Compound-Target Pathway Network，CTP）网络模型的构建

结合核心复方有效活性成分、预测作用靶点与通路注释分析的结果，采用CytoscapeV3.7.1建立“化合物—靶点—通路”网络模型，以不同颜色的节点表示药物成分、潜在作用靶点及作用通路，并采用线来表示药效成分、预测的作用靶点、作用通路之间存在关联或映射关系。

2 结果

2.1 药物使用频次统计

本研究收集治疗肿瘤方剂296条，共使用中药383味。对处方中的药物频次进行统计，药物使用频次≥30的药物有27味，小于10的有284，在两者之间的有72味。使用频次最多的药物是黄芪，使用了116次。使用频率最高的前10味药物依次为：黄芪、白术、茯苓、甘草、白花蛇舌草、当归、党参、莪术、半枝莲、熟地黄。见表1。

2.2 药物性味归经

在383味药物的属性中，经统计得出：四气性寒的药物最多，频数高达143，占40.5%;以味苦为主，使用199次，占45.5%，其次味甘、味辛，分别占23.3%、20.9%。药物归肝经最多，有202次，占22.9%;其次为肺经151次，占16.5%。见表2。

2.2 基于关联规则的组方规律分析

设定支持度个数为26，置信度为0.55，得到10种核心药物，共组成26组常用组合。按照药物组合出现频次由高到低排序。见表3。使用频率最高的5种药物组合依次为“白术-茯苓”“黄芪-白术”“黄芪-茯苓”“党参-黄芪”“白花蛇舌草-黄芪”。选择“规则分析”，根据药物关联规则得出药物组合规律共27组，其中“党参，茯苓->白术”“黄芪，茯苓->白术”“甘草，茯苓->白术”“白花蛇舌草，白术->黄芪”为置信度较高的4种药物组合规律。药物组合按照置信度由高到低排序。见表4。并根据支持度与置信度绘制10种核心药物的网络关系图。见图1。根据君臣佐使配伍规律及临证经验，我们从核心药物中推导出核心复方“癌毒清”（白花蛇舌草-黄芪-莪术-甘草），并进行后续网络药理学研究。

2.4 ADQ活性化合物的筛选

在TCMSP数据库中，以OB≥30%且DL≥0.18为筛选条件进行筛选并去除重复项，癌毒清中四味中药共有118种化合物通过筛选，其中甘草有92种，莪术有3种，黄芪有20种，白花蛇舌草有7种。在118种化合物中，有8种化合物未能在TMCSP中找到对应靶点，故将其剔除。使用TMCSP查找剩余的110种化合物的对应靶点共计有255个。将255个靶点名称输入Uniprot，限定”human”为筛查范围，筛得能在Uniprot中找到对应基因的靶点共240个，剩余15个未能在Uniprot中找到对应基因的靶点予以剔除。重新整理剩余化合物与靶点基因的关系，剔除无对应基因靶点的化合物，剩余化合物统计共108种。表5为靶点数最多的20个活性化合物信息。

2.5 构建ADQ化合物-靶点网络图及获取核心基因

在中药研究中，化合物-靶点网络图是一种展示化合物与其对应靶点关系的手段。癌毒清的化合物-靶点网络图如图2A所示。由图可知，对应靶点数最多的4种化合物分别是quercetin（353种）、kaempferol（83种）、naringenin（66种）和isorhamnetin（60种）。Gene Cards数据库共有21 669种基因与肿瘤相关。将癌毒清中240种潜在的活性靶标与21 669种肿瘤相关基因进行映射，得到230个共同靶基因，即潜在的ADQ抗肿瘤作用基因。将230个癌毒清潜在抗肿瘤基因输入String11.0构建PPI网络。见图2B。PPI网络由163个节点和2 287条边组成。通过Cytoscape CytoNCA的可视化拓扑分析获得“degree”，“betweenness”和“closeness”3个拓扑特性。以degree>50（中位数的两倍）作为筛选标准，得到52个核心基因，其中IL6相关性最高，其次为TP53，MAPK3，VEGFA，TNF、CASP3、JUN、MAPK8、EGF、EGFR、MYC等。见表6。

2.6 GO分析及KEGG通路富集分析

使用David数据库对52个靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。见图3A、图3B、图3C。选取P<0.05为是有显著相关度的通路。GO富集结果显示：生物学过程（Biological Process，BP）有关通路共有432条，其中P小于0.05的共有351条，主要与“药物反应（Response to Drug）”“凋亡的负反馈（Negative Regulation of Apoptotic）”“RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正調控（Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase II Promoter）”“血管生成（Angiogenesis）”和“转录的正调控DNA模板（Positive Regulation of Transcription，DNA-templated）”等相关。细胞成分（Cellular Component，CC）相关通路有42条，其中P小于0.05的共有36条，主要与“细胞外间隙（Extracellular Space）”“细胞外液（Extracellular Region）”和“胞质成分（Cytosol）”等相关。分子功能（Molecular Function，MF）相关通路有64条，其中P值小于0.05的共52条，主要与分子与蛋白的结合过程和蛋白活性的调节相关。KEGG通路分析结果显示，交集基因共参与106条通路的调节，其中P<0.05的有98条，与肿瘤相关的有50条。选取与肿瘤相关度最高的20条富集结果（图3D）进行分析，发现关键靶点涉及的信号通路主要包括炎性反应相关通路（TNF SignalingPathway，HIF-1 Signaling Pathway，FoxO Signaling Pathway，PI3K-Akt Signaling Pathway，NOD-like Receptor Signaling Pathway，MAPK Signaling Pathway，ErbB Signaling Pathway）、细胞凋亡相关通路（p53 Signaling Pathway）、免疫因子相关通路（Toll-like Receptor Signaling Pathway，T cell Receptor Signaling Pathway）、营养因子相关通路（VEGF Signaling Pathway），主要涉及膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌等的生物学过程。

2.7 药物活性成分、核心靶点及通路网络的构建

根据KEGG富集结果，选择与肿瘤相关度最大的通路“Pathway in Cancer”，分析白花蛇舌草、莪术、甘草、黄芪与肿瘤相关的作用靶点与该通路的关系。见图4。其中红色星号标记的为化合物与疾病相关的靶点。白花蛇舌草、莪术、甘草和黄芪可以调节通路图中55个节点，可以作用于“持续性血管生成（Sustained angiogenesis）”“增殖（Proliferation）”和“逃避凋亡（Evading apoptosis）”等多条信号通路，这说明了白花蛇舌草、莪术、甘草和黄芪活性成分对肿瘤的网络化调节模式是多靶点、多通路、多机制的。我们通过上述分析，最终筛选出95个药物活性成分，52个核心靶点与98个通路。通过对应的关系建立癌毒清的药物活性成分-核心靶点-通路图。见图5。

3 讨论

本研究运用关联规则、聚类算法和网络药理学分析对国家名老中医治疗肿瘤的用药规律进行了深入分析。结果显示名老中医经方、验方中的常用药物以补气健脾（黄芪、白术、甘草、党参、人参）、清热解毒（白花蛇舌草、半枝莲、生地黄、山慈菇）、补益气血（当归、熟地黄、白芍）、破血消癥（莪术、穿山甲）、利水渗湿药（茯苓、薏苡仁）为主;药性则多属寒、温;药味多为苦、甘。药物归经频率最高的前五位依次为肝经、肺经、胃经、脾经、肾经。从统计结果分析，常用药物与调和脏腑有关，或对改善肿瘤病机具有较强针对性。中医认为正气亏虚为肿瘤的发病基础，热毒内蕴阻滞气机则为肿瘤发病的关键病机。机体脏腑功能失调，以脾胃虚弱为甚，易酿生湿、热、痰、瘀、虚等病邪，病邪相互胶结，使气血不畅、脉络瘀阻，或兼痰湿凝滞，故久而成积。病邪愈炽，破血妄行，机体损阴耗阳加重正虚，故形成恶性因果循环，使癌肿迁延进展[6-7]。故历代医家对肿瘤辨证论治多以扶正祛邪为主要治则，时时健脾补肾扶助正气，兼顾活血化瘀、清热解毒、化痰散结等法以改善气滞血凝。以攻补兼施之法贯穿始终，方能达到“养正积自消”的目的。

以国家名老中医“驱邪扶正、攻补兼施”用药思路为纲，并结合临证经验，我们从大数据所得核心药物中选取白花蛇舌草、莪术、黄芪、甘草组成核心复方“癌毒清”。数据研究提示，方中用药为高频药对（白花蛇舌草-黄芪、甘草-黄芪、莪术-黄芪频次均大于30），且具有较高的置信度（莪术->黄芪、白花蛇舌草->黄芪置信度均大于0.58）。方中以白花蛇舌草为君药，其性寒味苦，行清热解毒、化痰散结之功;黄芪补而不塞、温而不燥，故为佐药，补中益气，以扶正气;佐以莪术活血通络，取其破血不留瘀，活血不伤正的特点，恰能协助白花蛇舌草软坚散结，协同黄芪补益气血，三药相伍，化瘀通络，以消癌毒阻滞。甘草生用以作使药，既取其调和全方诸药之性，又用其清热解毒抗肿瘤之功，亦可补益脾气。四药相合，共奏健脾益气，清热解毒、活血化瘀之效。

诸多研究证实癌毒清中4味单药均具抗肿瘤作用，且其作用机制与网络药理学预测所得的富集通路、核心靶点、相关生物学过程等密切相关。白花蛇舌草可通过协调细胞增殖分化、迁移侵袭、凋亡等多种生物学过程抑制肿瘤发生发展。有学者发现[8]白花蛇舌草乙醇提取物可靶向作用于ERK/p38-MAPK信号通路，抑制MCF-7乳腺癌细胞中MMP-9和ICAM-1的表达，从而阻断乳腺癌细胞侵袭和转移。亦有研究证实[9]类黄酮提取物下调TNF-α，IL-6和IL-1βmRNA水平，并降低MAPK信号通路的相关分子磷酸化，从而发挥抗炎活性。临床上黄芪广泛用于抗肿瘤免疫疗法辅助用药，起减轻不良反应、提高免疫力之效，目前广泛认为黄芪的抗癌机制为直接抗肿瘤作用与宿主免疫应答的激活。研究发现[10]黄芪多糖以剂量依赖性的方式激活巨噬细胞释放NO、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），并通过增加Bax/Bcl-2比例来诱导乳腺癌肿瘤细胞凋亡。在调节机体免疫平衡上，黄芪多糖不仅能通过CXCR4/CXCL12靶向抑制Treg细胞募集至肿瘤微环境，还可上调IFN-γ，IL-4的水平以促进Th1分化过程，从而抑制肝细胞癌逃避免疫监视[11]。此外，小鼠体内实验还发现黄芪多糖可下调MDR1 mRNA和P-GP，提高化疗药物敏感性，从而减少多药耐药的发生[12]。大量研究表明莪术具有强大的抗癌活性，其主要机制为激活癌细胞中的凋亡途径和抑制促癌过程如炎性反应、肿瘤血管的生成与转移。莪术中活性化合物β-榄香烯能通过Fas/FasL途径直接诱导肿瘤细胞凋亡[13]，亦能通过下调细胞周期蛋白A（cyclin A）、cyclin B1及上调p21WAF1/CIP1、p53蛋白使肿瘤细胞发生G2/M期细胞周期阻滞[14]。与此同时，莪术在调节肿瘤的炎性環境中具有强大的能力。β-榄香烯可调节关键炎性因子如TNF-α，IL-6，IL-10的表达水平，并抑制IL-6/STAT3途径从而发挥抗炎作用[15]。同时大量研究证实β-榄香烯可通过抑制VEGF诱导的血管生成[16-17]，并通过下调MMP-2、MMP-9、生长因子-β（TGF-β），上调E-钙粘蛋白来减少上皮-间质转化的发生，抑制肿瘤细胞的侵袭转移[18-20]。甘草有扶助正气之效，其抗肿瘤作用与调节免疫平衡相关。甘草酸抑制DC/巨噬细胞释放IFN-γ，IL-6，TNF-α和IL-17等炎性反应递质，影响T辅助细胞（Th17、Th1、Th2、Treg）的发育分化，调节Th1/Th2和Treg/Th17平衡并趋于向Th1和Treg为主导的方向发展[21-22]。亦有研究发现甘草能靶向癌细胞自噬与凋亡过程。甘草活性成分异甘草素通过抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激活与上调自噬因子Atg5，使腺囊癌细胞发生mTOR依赖性自噬和凋亡细胞死亡[23]，同时大量研究证实[24-25]异甘草素可通过下调Bcl-2，cycD1及上调Bax，p53，p21水平，直接发挥促肿瘤细胞凋亡作用。

本课题组前期实验亦证实[26]，癌毒清显著增强了紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡能力，并通过作用于核心靶点caveolin-1改善了乳腺癌耐药细胞的化学敏感性，与此同时还进一步触发细胞周期相关蛋白p21/cyclinB1及凋亡相关蛋白PARP1，BAX和Bcl-2的表达变化，使肿瘤细胞发生G2/M期阻滞。我们结合网络药理学数据挖掘结果与参考单味中药的研究结论，并根据核心基因的生物学功能与相关通路，将癌毒清治疗肿瘤的机制归纳为4类：1）促进肿瘤细胞凋亡;2）调控免疫平衡;3）抑制缺氧和炎性微环境;4）抑制新生血管形成。但癌毒清涉及多通路多靶点，其抗肿瘤作用、靶点和分子机制仍然需要进一步临床和基础验证。

中药方剂成分复杂，历代医家治疗肿瘤经验丰富，本研究通过总结名老中医治疗肿瘤临床遣方用药规律，挖掘核心复方并探讨其配伍的科学性，为中医方剂的溯源分析、传承中医用药经验、提高中医药临床疗效提供了方法学参考。本研究还利用网络药理学技术预测癌毒清主要活性成分、核心靶点、核心通路，在系统层面上揭示癌毒清治疗肿瘤可能的信号通路与生物学过程，为后续分子机制進一步研究与新药开发提供理论基础。

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（2020-03-24收稿 责任编辑：徐颖）