丹参酮ⅡA磺酸钠对大鼠肠缺血再灌注肺损伤的作用及机制研究

王敏，王俊帅，占大钱，郑鹏，刘旭东，明晓青，周代星，冯俊

肠缺血再灌注(intestinal ischemia/reperfusion,II/R)常见于肠道手术、严重失血性休克、严重多发伤等危重患者。II/R破坏肠黏膜屏障，导致肠内细菌及内毒素等有害物质迅速移位，介导多种炎性细胞因子及炎性介质的释放，诱导全身炎性反应综合征(SIRS)进而导致机体器官功能障碍[1]。其中，急性肺损伤(ALI)是常见的II/R所致的靶器官损伤[2]。目前临床上对II/R所致急性肺损伤的治疗手段有限，因此，研究有效的药物对该病的治疗极为重要。丹参酮ⅡA作为传统中药丹参酮的主要成分，其药理功效多样，具有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗心肌肥厚、改善脏器纤维化等作用[3-4]。研究表明，丹参酮ⅡA在多种肺损伤模型中如脓毒症肺损伤、重症胰腺炎肺损伤、爆震伤肺损伤中均有明确的肺保护作用[5-7]。但丹参酮ⅡA在II/R所致肺损伤中的作用目前尚无报道。因此，本研究从II/R所致急性肺损伤着手，观察丹参酮ⅡA磺酸钠对II/R所致急性肺损伤的疗效，并研究其作用机制，以期为临床治疗II/R所致急性肺损伤提供一种新的备选药物，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1) 动物：30只SD 雄性大鼠，体质量180～220 g，由湖北省实验动物研究中心提供，饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心，饲养温度22℃、湿度55%，各组大鼠术前禁食不禁水。本次动物实验符合动物伦理委员会的要求。(2) 药品与试剂：丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(上海第一生化药业有限公司)；大鼠IL-6、TNF-α ELISA试剂盒(武汉博士德有限公司)，大鼠IL-1β ELISA试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司)；NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65(pSer536)抗体 (Abcam公司，USA)，GAPDH、TLR4抗体(Cell Signaling Technology，USA)；细胞总蛋白提取试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司)。(3)仪器设备：动物血气分析仪(Premier3000型，美国GEM公司生产)；显微镜(Olympus IX71 型，日本 OLYMPUS 生产); 电泳仪(EPS-300型，上海天能科技有限公司生产)；离心机(Avanti J-15R型，美国贝克曼库尔特公司生产)。

1.2 实验方法 实验于2019年1—12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院进行。(1)模型制备：30只健康雄性SD大鼠随机分为假手术+NS组(Sham组)，肠缺血再灌注+NS组(II/R 组)，肠缺血再灌注+丹参酮ⅡA磺酸钠注射液组(Tanshinone ⅡA组)，每组10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后固定，Sham组大鼠仅打开腹腔，不行肠缺血再灌注手术处理，另外2组打开腹腔并钝性分离肠系膜上动脉，通过手术夹闭SD大鼠肠系膜上动脉90 min，再予以灌注6 h的方法构建大鼠肠缺血再灌注肺损伤模型。Tanshinone ⅡA组大鼠在手术前2 h通过尾静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(20 mg/kg), II/R组大鼠及Sham组大鼠分别于手术前2 h通过尾静脉注射等量的生理盐水。(2)标本收集与保存：实验结束后处死大鼠，充分暴露气管和肺组织，用16G静脉留置针进行气管插管，结扎右侧主支气管，用1.0 ml PBS行单侧肺泡灌洗1 min ,抽取灌洗液0.7～0.8 ml，反复3次，收集肺泡灌洗液以3 000×g离心15 min,回收上清于-80℃冰箱保存。取右肺上叶，经4%多聚甲醛充分固定后用于制作病理切片。取右肺中叶用于湿/干(W/D)比值检测，取右肺下叶立刻放入液氮罐冷冻后-80℃冰箱保存进行Western-blot检测。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 肺组织病理改变的评定： 取大鼠右肺上叶肺组织，经4%多聚甲醛固定24 h后常规石蜡包埋、脱蜡后行HE染色，染色后的切片经脱水、透明、封片后采用显微镜进行拍照，通过对图片进行评分观察其病理状态的改变。参照孟志鹏等[8]使用的方法从中性粒细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡腔内出血及渗出四个方面进行大鼠肺组织急性肺损伤评分。

1.3.2 肺动脉氧分压(PaO2)的测定及肺组织W/D比值测定：实验结束后取血，各组大鼠左心室取血1 ml，全自动血气分析仪测定各组大鼠PaO2；取大鼠右肺中叶，吸水纸充分擦吸完表面水分后称其湿重，之后置于60℃恒温烤箱中连续烘烤24 h后再称干重，计算W/D比值。

1.3.3 肺泡灌洗液(BALF)蛋白、炎性细胞因子检测：将存于-80℃冰箱中的肺泡灌洗液室温解冻后，按照BCA试剂盒的操作步骤检测BALF蛋白浓度，依据检测说明书按步骤采用ELISA法检测BALF中IL-6、 TNF-α及 IL-1β的浓度。

1.3.4 肺组织TLR4、pNF-κB p65蛋白表达的测定：将存于-80℃冰箱中的肺组织取出解冻，充分研磨制成匀浆后冰上裂解30 min，之后离心15 min获取上清液，BCA法测定蛋白浓度。制作10%凝胶后，蛋白上样每孔30 μg，电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h ,加入TLR4一抗(1∶1 000 稀释)、GAPDH一抗(1∶1 000稀释)、NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65(pSer536)一抗(1∶1 000稀释),4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次，10 min/次，加入羊抗兔二抗(稀释度1∶2 000)，室温孵育1 h，ECL显影液显色后曝光成像，采用Image-pro Plus 5.1图像分析软件测定光密度值，以磷酸化NF-κB p65(pSer536)与NF-κB p65的比值反映NF-κB p65磷酸化水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理学变化 成功构建大鼠肠缺血再灌注肺损伤模型，HE染色示：Sham组大鼠肺泡结构完整，无明显病理改变；II/R组大鼠肺组织结构破坏严重，肺间质水肿、肺泡壁增厚明显，较多炎性细胞浸润；Tanshinone ⅡA组大鼠肺泡增厚及间质水肿程度明显减轻，仅有少量炎性细胞浸润，见图1。

2.2 各组大鼠急性肺损伤评分、PaO2比较 各组大鼠急性肺损伤评分：与Sham 组比较，II/R组大鼠急性肺损伤评分明显升高；与II/R组比较，Tanshinone ⅡA组大鼠急性肺损伤评分明显降低 (P均<0.01)。各组大鼠PaO2比较:与Sham组比较，II/R组大鼠PaO2明显减低；与II/R组比较，Tanshinone ⅡA组大鼠PaO2明显升高(P均<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠急性肺损伤评分、PaO2比较

2.3 各组大鼠肺组织W/D、BALF蛋白浓度比较 与Sham 组比较，II/R组肺组织W/D、BALF蛋白浓度明显升高；与II/R组比较，Tanshinone ⅡA组肺组织W/D、BALF蛋白浓度明显降低(P均<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠肺组织W/D、BALF蛋白浓度比较

2.4 各组大鼠BALF中炎性细胞因子的变化比较 与Sham 组比较，II/R组大鼠BALF中炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平明显升高；与II/R组比较，Tanshinone ⅡA组上述指标均明显降低(P均<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠BALF炎性细胞因子水平比较

2.5 各组大鼠肺组织TLR4、pNF-κB p65蛋白的表达比较 与Sham 组比较，II/R组肺组织TLR4、pNF-κB p65蛋白的表达水平明显升高；与II/R组比较， Tanshinone ⅡA组肺组织TLR4、pNF-κB p65蛋白的表达水平明显降低(P均<0.01)，见表4。

图1 各组大鼠肺组织病理变化比较(HE染色，×200)

表4 各组大鼠肺组织TLR4、pNF-κB p65蛋白表达比较

3 讨 论

肠缺血再灌注可引起肠道局部的一系列病理生理改变，如氧自由基的产生、细胞膜脂质过氧化、细胞内钙超载、炎性细胞聚集、内皮细胞肿胀、凋亡及坏死等，导致肠黏膜屏障破坏及肠道内毒素和细菌等有害物质进入体循环，进而激活单核/巨噬细胞系统，介导炎性介质及细胞因子的大量释放，从而诱导全身炎性反应综合征，导致多器官功能损伤[9-10]。其中，急性肺损伤是常见的II/R所致的靶器官损伤，其发病率高、病死率高[11]。

丹参酮ⅡA是传统中药丹参主要成分，丹参酮ⅡA磺酸钠是丹参酮ⅡA的水溶性衍生物，其功效多样[12]。本研究结果显示，丹参酮ⅡA磺酸钠处理后II/R 大鼠肺组织急性肺损伤评分降低、动脉血PaO2水平增加，提示丹参酮ⅡA磺酸钠对II/R 大鼠急性肺损伤具有明显保护作用。多项研究表明，急性肺损伤时，肺血管内皮屏障破坏，肺血管通透性增加，肺泡内蛋白浓度升高，炎性介质及炎性细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β大量释放[13-16]。本研究结果表明，丹参酮ⅡA磺酸钠处理后II/R 大鼠W/D 比值降低、肺泡灌洗液中的蛋白浓度降低，提示丹参酮ⅡA磺酸钠能够显著降低II/R大鼠肺血管通透性。此外，本研究结果表明,丹参酮ⅡA磺酸钠处理后II/R大鼠肺泡灌洗液中炎性细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平显著降低。上述结果表明, 丹参酮ⅡA磺酸钠可通过减轻II/R大鼠肺血管通透性、减轻炎性细胞因子的表达进而发挥抗炎作用, 对II/R所致肺损伤起到保护作用。

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)属于模式识别受体，TLR4是其中重要的一员，多项研究表明，在包括肠缺血再灌注肺损伤在内的各种肺损伤模型中，TLR4发挥着重要的作用。TLR4能识别细菌来源的LPS及透明质酸、热休克蛋白、硫酸乙酰肝素等内源性配体，进而激活下游的信号通路，发挥抗炎性反应、抗氧化作用[17-19]。其中NF-κB是其下游最重要的信号通路之一，在炎性反应中起到关键作用。 NF-κB由多肽链 p65 和 p50 蛋白亚基构成，生理静息状态下，NF-κB的 p65 亚基与 IκB 蛋白结合，使 NF-κB 位于细胞质中。当细胞受到各种内、外界因素刺激时，IκB 磷酸化后被降解，NF-κB p65亚基磷酸化后得以激活并进入细胞核，介导多种炎性细胞因子基因的转录调控，进而激活并放大炎性反应[20-24]。多项研究表明，TLR4/NF-κB 的活化在多种肺损伤的动物模型中发挥明显作用[25-29]。本研究结果表明,经丹参酮ⅡA磺酸钠处理后，II/R组大鼠肺组织TLR4、pNF-κB p65表达明显降低，提示丹参酮ⅡA磺酸钠能够抑制II/R大鼠肺组织TLR4/NF-κB的活化。丹参酮ⅡA磺酸钠对II/R 所致肺损伤的保护作用可能与其抑制TLR4/NF-κB的活化、减轻肺部炎性反应有关。

综上所述，丹参酮ⅡA磺酸钠对II/R 所致肺损伤具有明显的保护作用，其保护作用可能与抑制TLR4/NF-κB 的活化进而抑制肺部炎性反应有关，丹参酮ⅡA磺酸钠是潜在的治疗II/R 所致肺损伤的候选药物。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

王敏: 设计研究方案，实施研究过程及论文撰写；王俊帅、占大钱:提出研究思路，分析实验数据；郑鹏、刘旭东、明晓青：实施研究过程，资料收集整理；周代星、冯俊：实验指导，论文修改及论文审核