羊乳中牛乳成分的环介导等温扩增高分辨熔解检测

张文娟，澹台玮，李敏康，蔡露阳，徐秦峰

(陕西科技大学 食品与生物工程学院,国家羊乳制品加工技术研发专业中心，陕西 西安，710021)

乳是儿童和成年人健康生长所需的各种营养物质的来源之一[1]。由于乳制品需求的增加和供应链的全球化，某些供应商为追求经济利益，常在乳制品中掺入一些不易区分、同源性更高的动物源性产品和原料来降低成本，其中最常见的掺假形式是在高值羊乳中掺入低值牛乳[2-3]。这种掺假行为不仅会影响行业健康发展，也更容易增加过敏的风险[4-7]。因此，检测此类产品的掺假情况对核实食品标签成分，保护消费者的合法权益等具有重要意义。

鉴别牛、羊乳品质有蛋白水平、脂肪水平和核酸水平上的方法[8]，相比而言，核酸分子水平上的检测稳定性更高[9]，且DNA具有很强的种属特异性，使其被越来越多地用于乳制品的检测中。已有的核酸水平上的检测方法有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)[10-11]、聚合酶链式反应-高分辨率熔解曲线(PCR-high resolution melting，PCR-HRM)[12-14]、单重实时环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术[15]等。常规的PCR技术，依赖于昂贵的热循环仪器，而LAMP技术只需恒温水浴锅，但单重LAMP技术在检测多个靶标时需要进行大量繁琐、重复性的工作，难以满足当今用户需求。随着核酸分子技术的快速发展，在食品及乳制品的检测中多重检测可满足一次反应多靶标扩增，快速对现场大量的复杂样品及未知样品做出验证。KIM等[16]基于荧光探针法建立了双重实时LAMP技术对牛奶和羊奶进行检测，但是不同的靶标需要合成不同的荧光标记探针，使得成本增高。

HRM是基于饱和荧光染料发展起来的一种新型PCR检测技术，在普通熔解曲线的基础上依据更小的熔解温度差异鉴别不同的目的基因，并依靠特殊仪器获得更高密度数据值。GANOPOULOS[17]使用PCR-HRM技术检测出羊乳奶酪中的牛乳成分，为该技术在乳及乳制品的掺假检测应用中奠定了基础。本研究针对奶牛和奶山羊线粒体DNA设计LAMP特异性引物，通过对不同引物比例及反应温度的优化，利用HRM技术对Tm值差异较小的牛羊乳扩增产物进行准确有效区分，实现了羊乳中掺入牛乳成分的检测。

1 材料与试剂

1.1 实验材料

新鲜牛乳样品采集于陕西省西安市未央区某奶牛场，新鲜羊乳样品采集于未央区某市场农户处，样品存于-20 ℃冰箱备用;其他用于验证引物特异性DNA(鸡、猪、马、兔、鸭、狗和猫)样本购买于四川华汉三创有限公司;其他不同类型全脂羊奶产品、低脂羊奶产品、羊奶片等实际样品随机购买于大型商场。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 试剂

磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒，天根有限公司；甜菜碱，Sigma公司；dNTP混合液、Bst 2.0 Warm Star DNA聚合酶和MgSO4等，NEB公司。

1.2.2 仪器

荧光定量PCR仪(MyGo Pro)，IT-IS Life Science Ltd；实时荧光定量PCR仪(Qtower 2.2)，德国耶拿公司；电热恒温水槽(DK-8D)，上海精宏实验设备有限公司；高速冷冻离心机(5424R)，Eppendorf 有限公司；超微量分光光度计(Q6000)，美国Quawell。

2 实验方法

2.1 DNA的提取

按照磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒说明书对上述新鲜乳品或羊乳制品中的DNA进行提取。使用超微量核酸定量仪测定鲜牛乳、鲜羊乳DNA质量浓度，将溶液稀释到7 ng/μL，-20 ℃保存备用。

2.科学制定实施方案。2017年，山西农垦依据中央政策，结合调查摸底情况和我省实际，多次征求各市农垦主管部门及26个农场和省编办的意见，由省农业厅、财政厅、教育厅、卫生和计划委员会、民政厅、中国人民银行太原中心支行共同研究起草了《山西省农垦国有农场办社会职能改革实施方案》，进一步明确了工作原则、改革内容、实施步骤及责任分工。之后，有改革任务的各市县也分别制定了符合自身实际的办社会职能改革实施方案。

2.2 LAMP引物设计及筛选

参考SN/T 4419.21—2016[18]标准及文献报道的引物序列[19]，以牛、羊线粒体保守序列为靶基因，并在PrimerExplorer 5网站进行多次筛选比对来合成LAMP特异性引物，如表1所示。LAMP引物由生工生物(上海)有限公司合成并经高效液相色谱纯化。

表1 实验中所用的LAMP引物序列Table 1 Primers pairs used in LAMP for goat and bo ine

2.3 LAMP-HRM反应体系建立及条件优化

LAMP反应体系的组成及浓度如下：1×Thermol Pol缓冲液、1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mol/L甜菜碱、4 mmol/L MgSO4、外引物F3和B3各0.2 μmol/L、内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L、8 U DNA聚合酶0.4 μL、20×E a Green荧光染料0.25 μL和DNA模板7 ng，总反应体系为10 μL。将混合体系置于实时荧光PCR仪中64 ℃反应45 min，65～97 ℃进行熔解分析。

根据上述LAMP反应的实验结果，通过改变反应温度及引物比例对LAMP反应条件进行优化，以确定最佳的反应条件。LAMP扩增所用的酶最适反应温度为60～68 ℃，当反应温度降到60 ℃以下时，聚合酶的酶活力减弱，扩增效率降低，因此选择60、61、62、63、64和65 ℃ 6个温度对反应体系进行优化。改变奶牛和奶山羊的引物用量体积比例，即0.1∶0.2、0.15∶0.2、0.2∶0.2、0.1∶0.3、0.1∶0.4，以挑选出最适引物浓度比。

2.4 LAMP-HRM反应特异性、灵敏度和牛羊乳不同混合比例检测

按照LAMP体系配制反应液，加入质量浓度均为7 ng/μL的不同模板DNA，在最适反应温度下进行扩增，分析鉴定扩增曲线及熔解曲线，以验证LAMP引物的特异性。

将牛乳和羊乳提取的DNA原液等比例混合，再进行10倍质量浓度梯度稀释，即反应体系中DNA质量浓度分别为7、0.7、0.07、0.007和0.000 7 ng/μL，每个质量浓度梯度均取1.2 μL为反应模板，进行LAMP检测。通过对熔解曲线的Tm值进行分析来检测方法的灵敏度。

取7 ng/μL的羊乳DNA为原液，分别掺入不同体积比例的牛乳DNA，体积比例依次为100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%和0%，取1.2 μL上述混合DNA作为模板进行LAMP扩增，分析此方式的检测限。在羊乳实际样品中混合不同体积比例的牛乳，混合体积比例为100%、50%、15%、5%、1%、0.5%和0%，再进行DNA提取，确定此种混合方式的检测限。

2.5 实际样品检测

对市售的8种乳制品进行鉴定，通过对熔解曲线进行分析来评价LAMP-HRM方法的实际应用能力，与已建立的实时PCR方法进行比较，验证其方法的准确性。

3 结果与分析

3.1 LAMP-HRM方法可行性

a-传统熔解峰; b-高分辨熔解峰1-牛;2-牛+羊;3-羊;4-NTC图1 LAMP-HRM可行性的验证Fig.1 erification of LAMP-HRM feasibility注:动物名称代表各自DNA;NTC代表on template control,无DNA阴性性对照(下同)

3.2 LAMP-HRM反应体系的优化

3.2.1 反应温度优化

为了消除由于温度影响而产生的竞争性扩增，选取牛羊DNA扩增子熔解峰面积相近时的反应温度作为最佳扩增温度，此时2种扩增子含量接近，扩增效率相当[21]。结果如图2-a所示，在60～65 ℃温度范围内，即使1 ℃的温度变化，牛、羊源性DNA成分的熔解峰也有较大差距，说明温度对双重扩增影响较大。观察到在63 ℃时，2种熔解峰面积接近，因此选择63 ℃作为后续检测的最佳反应温度。

a-反应温度优化; b-引物浓度比优化图2 LAMP-HRM反应体系的优化Fig.2 Optimization of LAMP-HRM reaction system

3.2.2 引物浓度比优化

在多重LAMP反应中，由于不同靶标的引物对之间存在竞争关系而产生优势扩增，容易导致其靶目标序列扩增效率的不同[22]。为了使扩增效率一致，减少不同引物对之间的相互竞争，从而更清楚地区分2种DNA。如图2-b所示，选择引物浓度比为0.15∶0.2的一组，该比例条件下等温扩增效率相对较高，更适合对乳制品中牛、羊源性成分同时进行检测。

3.3 LAMP-HRM体系的特异性实验、灵敏度检测和牛羊乳不同混合比例检测

3.3.1 特异性检测

利用建立的双重LAMP-HRM方法对牛、羊及其他7种动物进行LAMP扩增并进行熔解分析。由图3-a可知，含有奶牛、奶山羊的反应体系均有单峰出现，奶牛和奶山羊的混合物也出现双峰，而其他动物DNA模板均未出现熔解现象，表明建立的双重LAMP-HRM方法具有较好的特异性，且设计的引物特异性也较好。

3.3.2 灵敏度检测

将提取出的牛奶和羊乳线粒体 DNA混合物经逐级稀释后，如图3-b结果所示，建立的LAMP-HRM方法能够检测到0.7 pg/μL的牛和羊DNA混合物，表明该方法具有较高的检测灵敏度。

a-特异性; b-灵敏度图3 LAMP-HRM反应体系的特异性和灵敏度Fig.3 Specificity and sensiti ity for LAMP-HRM reaction system

3.3.3 牛羊乳不同混合比例检测

将牛乳和羊乳DNA不同混合比例样品按照最优反应体系进行LAMP-HRM检测,检测结果如图4-a所示。当掺入0.1%牛乳DNA时，该反应体系内仍可观察到清晰的熔解信号。尽管1%的牛乳熔解峰值高于5%,但更进一步发现，牛羊乳峰高比值与相应的混合比例呈现一定的相关性。因此可以确定牛羊乳DNA混合的检出限为0.1%。为了进一步验证LAMP-HRM方法对实际样品的检测能力，在羊乳实际样品中混合不同比例的牛乳，再进行DNA提取，结果如图4-b，最低检出限为0.5%，这可能是因为乳本身体系的复杂性和乳中细胞分布的不均匀性，混合乳之后再进行DNA提取可能会造成提取不完全等。这2种方式混合比例的检测均表明LAMP-HRM方法灵敏度较高。

a-牛羊乳DNA混合比例; b-牛羊乳实际样品混合比例图4 牛羊乳不同混合比例的LAMP-HRM检测Fig.4 LAMP-HRM detection of different cow’s milk adulterated in goat’s milk注：图a和b中插图为各混合比例牛羊乳峰高比值相关性

3.4 市售样品的应用性检测

牛源性成分为羊乳品中最为常见的掺假成分。采用上述建立的双重LAMP-HRM方法对超市里销售的全脂奶产品、低脂奶产品、婴幼儿配方奶粉等8个商业产品进行了检测分析，并与实时PCR技术检测所得的数据进行比较，2种方法的检测结果见表2。结果表明，在分析的8种商业奶制品中，对于商品标签显示含有100%的4个羊乳样品，其中仅2个样品(3、6)显示与标识符合，4、5号样品则掺入了部分或全部的奶牛乳成分，与标签标识不符；对于配方羊奶粉，国家允许添加牛乳清粉，样品8、9、10均检测出牛源性成分，与标签标示相符。实时PCR技术检测显示，其检测结果与LAMP-HRM反应相比，结果完全一致，表明了LAMP-HRM检测方法在实际样品应用中的高准确性，可为大规模的牛羊乳样品初筛提供一种技术支持。

表2 LAMP-HRM反应体系对市售羊乳制品的应用性检测Table 2 Detection result of LAMP-HRM reaction system in goat milk products

4 结论

本研究将双重LAMP扩增技术与HRM技术相结合，针对奶牛、山羊分别设计了4条特异性引物，通过优化反应条件，利用不同靶标的Tm值差异对2种目标基因进行同时区分，建立了羊乳中牛乳成分的双重实时LAMP-HRM技术。结果表明，所建立的方法特异性好，当体系中存在其中一种或两种目标物时都可将其检出，且对其他物种没有交叉反应及假阳性现象的发生，对牛羊混合DNA的检测灵敏度可达0.7 pg/μL，并可用于不同市售样品的检测，适用于羊乳制品中掺入牛乳成分的快速检测。与PCR-HRM技术相比，该方法不需要复杂的热循环控温仪器，而且不需要针对奶牛、奶山羊源性成分单独进行检测、鉴别，在进一步节省时间的同时也提高了检测效率，降低了检测成本，适用于大规模样品的初筛。值得注意的是，多重LAMP-HRM检测方法的建立与优化，主要是在具有HRM检测能力的实时PCR仪器上完成，近年来发展的便携式恒温LAMP检测仪器已经具备了很高的温度分辨能力，也能够满足该方法应用于现场快速检测的需要。