微胶囊粒径对甜橙油中D-柠檬烯释放特性的影响

易灵，彭群，叶之壮，陆洁毅，王超，段翰英*

1(暨南大学 食品科学与工程系，广东 广州，510632)2(广州百花香料股份有限公司，广东 广州，510632)

甜橙油是柑橘属植物果实加工利用过程中重要的副产物，作为天然安全的植物香料在食品行业中被广泛应用。甜橙油中主要的化合物是单萜烯、倍半萜烯、碳氢化合物以及它们的氧合衍生物，其中D-柠檬烯含量高达97.4%[1-2],这些物质对O2、光热和湿度都非常敏感。同时，甜橙油难溶于水的特性也不利于其在食品体系中的应用。目前,国内外最常用的方法就是通过微胶囊技术包埋甜橙油提高其稳定性和缓释效果，从而拓展其在不同领域中的应用。

微胶囊技术是指将固体、液体或气体包埋、封存在微型胶囊内，成为一种固体微粒产品的技术[3]，从而保护其免遭挥发和氧化损失，并实现风味的控制释放[4-5]。乳化技术和包埋方法等是影响甜橙油微胶囊性能的主要因素。乳液的粒径大小对风味的释放具有关键性的作用，相比于高压均质的传统高压阀,高压微射流技术具有更好的超微化、微乳化和均一化效果，从而使制备的粒径更为均一，甚至达到纳米级别。喷雾干燥是一种简单、经济有效且广泛应用于精油类包埋微囊化的技术[6]。

微胶囊粒径大小可能会影响许多性能，如粉末的流动性、溶解速率、口感，甚至是产品的稳定性[7]。研究表明，乳液粒径会影响喷雾干燥微胶囊的粒径[8]，从而影响甜橙油微胶囊中D-柠檬烯等风味物质的稳定性和货架期[8-9]。不同贮藏条件(温度、湿度)下，芯材会有不一样的释放性能和动力学[10]。因此，研究D-柠檬烯在贮藏时的释放机制将有助于评估橙油类微胶囊的贮藏稳定性。

当甜橙油微胶囊添加到不同食品体系时，其主要风味物质D-柠檬烯的缓释效果将是影响其品质的重要因素，而粒径大小可能会影响风味化合物的空间分布，食品基质成分之间、基质成分与体系溶液之间的相互作用。现阶段关于甜橙油微胶囊的研究主要集中于制备工艺及理化性质研究，而有关微胶囊粒径对其风味物质缓释性能的研究却鲜少报道。本研究通过高压微射流均质和喷雾干燥制备了3种不同粒径的甜橙油微胶囊，研究在37 ℃不同相对湿度加速贮藏过程中,粒径对D-柠檬烯释放特性的影响，并通过水和酸2种典型的食品模拟体系[10]，建立甜橙油微胶囊在不同食品模拟体系中的释放模型，以期为甜橙油微胶囊的加工、贮藏和应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要实验材料

甜橙油，广州百花香料股份有限公司；松香甘油酯，武汉远成共创科技有限公司；CAPSUL®变性淀粉(食品级)，宜瑞安食品配料公司；麦芽糊精(DE=18，食品级)，河南飞天有限公司；2-庚酮(色谱级)，上海阿拉丁生化科技有限公司；正己烷(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂；冰乙酸，上海麦克林生化科技有限公司；D-柠檬烯(纯度97.8%)，德国DRE公司；蒸馏水。

1.1.2 主要仪器设备

T25 Basic ULTRA-TURRAX高剪切混合器, 德国IKA-Werke公司；Nano DeBEE高压微射流机, 美国BEE公司；Nano ZS纳米激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；LA-950激光散射粒度分析仪，日本Horiba公司；GENESYS 10S紫外可见光分光光度计，Thermo Scientific；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、7890B顶空气相色谱-7000C质谱联用仪、20 mL顶空瓶，美国安捷伦科技；PL203电子天平、DSC-5000差示扫描量热仪、梅特勒-托利多(上海)有限公司；PAL RSI，CTC多功能气相色谱自动进样器CTC Analytics AG； 1.5T单冲压片糖机，广州多顺有限公司；KQ-300E型超声波清洗器，北京赛欧华创科技有限公司； AW-2A型智能水分活度仪，无锡市碧波电子设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 甜橙油微胶囊的制备

将0.64 kg的变性淀粉与3.2 kg 80 ℃的蒸馏水在室温下用磁力搅拌器搅拌2 h，制备连续相，常温下放置过夜；同时制备0.32 kg混合油[m(甜橙油)∶m(松香甘油酯)=3∶2]作为分散相。在室温下将分散相缓慢均匀加入到连续相中，同时用高剪切混合器在9 500 r/min条件下混合5 min，混合均匀后得到粗乳液，均分为3份。

为制备不同粒径大小的乳液，以粗乳液为对照，将其余2份分别经高压微射流在5 000 psi (1 psi=6 894.757 Pa)压力下通过2次，22 000 psi 压力下通过3次。乳液中分别加入等量的麦芽糊精，按照彭群等[11]的方法进行喷雾干燥并收集粉末，分别得到大粒径粉末(large-size powder，LP)、小粒径粉末(small-size powder，SP)、纳米粒径粉末(nano-size powder，NP)。将喷雾干燥后的粉末储存在密封容器中，0 ℃冷藏。

1.2.2 微胶囊粒径的测定

微胶囊的粒径由重组乳液的粒径表征。重组乳液参照文献[12]配制：准确称取1.000 g粉末溶解于9 g水中，搅拌至完全溶解。将激光散射粒度分析仪设置好测量参数条件并校正调零，用胶头滴管吸取乳液后滴加到样品池中，超声30 s待红色条示数达80%时进行粒径的测定，重复3次取平均值。

1.2.3 微胶囊水分活度的测定

由水分活度仪测定微胶囊粉末的水分活度。先用饱和NaCl溶液校准，再分别在(25±1) ℃下测定，重复3次取平均值。

1.2.4 微胶囊水分质量分数的测定[13]

称取喷雾干燥后10.000 g粉末于干燥皿中，放入真空干燥箱中，设置温度为70 ℃，每隔20 min测定粉末的质量，直至质量恒定，重复3次取平均值。粉末的水分质量分数按公式(1)计算：

(1)

式中：m0，粉末的初始质量，10.000 g；mt，粉末达到恒重后的质量，g。

1.2.5 微胶囊在贮藏过程中D-柠檬烯释放特性

分别称取不同粒径的粉末20 g置于相对湿度为25%、33%、52%和75%的干燥器中，并于37 ℃恒温箱中贮藏进行加速实验。湿度由饱和MgCl2溶液进行调节，饱和盐溶液按照GB 5009.238—2016配制。分别在第0(样品平衡后)、1、2、3、4、5周取样并用GC-MS测定D-柠檬烯的峰面积，并计算其保留率，建立释放动力学模型。

1.2.5.1D-柠檬烯峰面积测定

参考YANG等[14]的GC-MS方法并有所改进。称取0.15 g粉末，加入0.85 g蒸馏水搅拌至完全溶解，再缓慢加入4 mL 质量分数为3.0 mg/g的 2-庚酮/丙酮内标液，静置5 min后将上述混合溶液过滤到进样瓶中，密封，进行GC-MS分析。

GC-MS条件参照彭群等[11]方法，设定升温程序为：初始温度50 ℃，保持2 min，以升温速率10 ℃/min升至140 ℃，保持2 min；再以升温速率30 ℃/min升至220 ℃，保持2 min。样品进样量为1 μL，不分流，溶剂延迟3.5 min。

1.2.5.2D-柠檬烯保留率计算

甜橙油微胶囊中D-柠檬烯的释放特性以D-柠檬烯的保留率表示，按公式(2)计算：

(2)

式中：R,D-柠檬烯的保留率,%;Dt，第t周粉末中D-柠檬烯的峰面积；D0，平衡后粉末中D-柠檬烯的峰面积；It，第t周时测定2-庚酮的峰面积；I0，平衡后测定2-庚酮的峰面积。

1.2.5.3D-柠檬烯释放动力学模型

D-柠檬烯的释放曲线可由A rami方程[15-16]拟合，如公式(3)所示：

R=exp[-(kt)n]

(3)

式中：R，D-柠檬烯的保留率，%；n，释放机制参数；k，释放速率常数；t，贮藏时间，周。

1.2.6 微胶囊玻璃化转变温度(glass transition temperature,Tg)的测定

微胶囊粉末在不同相对湿度平衡后，分别用差示扫描量热仪测定其Tg。准确称取10.000 mg样品于铝制坩埚里，密封后开始测定，并以空铝盘为参照样。加热和冷却速率为10 ℃/min，扫描的温度为-20～200 ℃[17]。所有的样品首先通过加热破坏样品的热历史，冷却后再加热。Tg即第2次扫描的基线偏移的中点。

1.2.7 甜橙风味压片糖的制备

按照质量比混匀各原料：山梨醇粉末60.4；麦芽糊精30；硬脂酸镁1；微晶纤维素5；柠檬酸2.5；三氯蔗糖0.1；甜橙油微胶囊1，通过压片机制备甜橙风味压片糖。将LP、SP和NP 3种微胶囊分别制备压片糖，并标记为S-LP、S-SP和S-NP。

1.2.8 压片糖主要挥发性风味成分分析

取3种压片糖各2片，分别放置于装有蒸馏水和体积分数3%乙酸溶液的20 mL顶空瓶中，加盖密封，平衡10 min后进顶空气相色谱-质谱联用仪进行分析。

1.2.9 模拟食品体系中D-柠檬烯释放特性的测定

1.2.9.1 压片糖缓释预处理

以蒸馏水和体积分数3%乙酸作为2种食品模拟体系[18]。准确称取质量相近的压片糖(0.60～0.64 g)和5 mL不同食品模拟体系溶液加入20 mL顶空瓶中，加盖密封，在30 ℃分别平衡2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 min后,经顶空气相色谱-质谱分析,读取D-柠檬烯的峰面积。

1.2.9.2 顶空气相色谱-质谱分析

(1)自动进样器参数

样品瓶穿刺深度25 mm；样品瓶穿刺速度50 mm/s；样品抽吸速度12 mL/min；进样口穿刺深度45 mm；进样口穿刺速度50 mm/s；预进样时间延迟0.5 s；进样速度10 mL/min；后进样时间延迟0.5 s；冲洗时间10 s，振摇速度250 r/min。

(2)GC-MS条件

色谱柱：HP-5MS Ultra Inert(15 m×250 μm,0.25 μm)，载气He，流量 1 mL/min。设定升温程序为：初始温度50 ℃，保持2 min，开始以升温速率10 ℃/min升至120 ℃，保持0 min，之后以升温速率50 ℃/min升至220 ℃，保持1 min。后运行时间3 min，温度为250 ℃。进样量1 μL，不分流。

1.2.9.3 压片糖中D-柠檬烯缓释动力学模型

将压片糖中D-柠檬烯缓释曲线用Peppas-Sahlin模型拟合，模型方程[19]如公式(4)所示：

Mt/M∞=k1tm+k2t2m

(4)

式中：t，平衡时间；Mt，平衡时间t时风味分子的释放量；M∞，风味分子的初始量；k1，扩散(Fickian)速率常数；k2，侵蚀(非Fickian)速率常数；m，释放可控的系统纯Fickian扩散指数。

1.3 数据统计与分析

数据以均值±标准差表示，利用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，P<0.05 为差异显著。采用Origin Pro 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 甜橙油微胶囊物理性质

喷雾干燥后得到的3种甜橙油微胶囊基本性质如表1所示。经高压微射流不同均质压力和次数得到3种具有显著粒径差异的微胶囊。随着高压微射流压力的增加，乳液粒径分布范围越窄，粒子分散越均匀，从而形成更均匀和更小粒径的微胶囊，这与彭群等[6]的研究结果一致。不同粒径大小的粉末含水量都低于4%(质量分数)，符合经喷雾干燥加工的商业化产品的水分含量要求(3%～6%)[20]。水分活度无显著差异，说明粉末的水分含量和水分活度应直接与喷雾干燥进出风温度有关[21]。因此，LP、SP和NP粒径有显著差异，可进一步研究粒径对微胶囊中D-柠檬烯的释放特性的影响。

表1 甜橙油微胶囊的物理性质Table 1 Physical properties of sweet orange oil microcapsules

2.2 粒径对贮藏过程中D-柠檬烯释放特性的影响

D-柠檬烯是甜橙油微胶囊的主要风味物质，因此，通过微胶囊贮藏过程中D-柠檬烯保留率探讨其释放规律。3种粒径微胶囊在37 ℃不同相对湿度贮藏5周后，D-柠檬烯保留率结果见图1。

α-LP;b-SP;c-NP图1 不同粒径微胶囊在加速贮藏过程中D-柠檬烯的保留率Fig.1 Effect of particle size on D-limonene retention during accelerating storage

LP、SP和NP中D-柠檬烯在5周内都有不同程度下降。经5周后，在低湿度下(相对湿度25%)，LP、SP和NP的D-柠檬烯的保留率均较高,分别为95.6%、97.4%和96.1%。而湿度增加时(相对湿度75%)，LP和SP的D-柠檬烯保留率分别降到71.3%和83.4%，但NP仍有91.9%。说明粒径和相对湿度都会对贮藏期间D-柠檬烯的释放产生影响。D-柠檬烯的释放与微胶囊壁材性质、表观形貌等都有关系，同时也与D-柠檬烯的氧化有关，一旦发生氧化，D-柠檬烯保留率就会下降。微胶囊孔隙型微结构使得氧气和水分可进入壁材及囊芯,使得芯材发生氧化等反应[22]。相对湿度越高，微胶囊亲水壁材在长期贮藏中吸收更多水分，发生溶胀，表观形貌改变，导致表面裂纹增加，且粒径越大颗粒微球表面纹路更多[23]，如果微胶囊的粒径过大,甚至易于破裂,从而导致精油更易释放或氧化[24]。因此，粒径最小的NP在不同相对湿度下D-柠檬烯损失最小。有研究表明，纳米粒径的橙皮精油微胶囊囊壁比较完整，有少量凹陷和裂纹但没有裂痕出现，因此其贮藏时氧化程度较低[11]。

将3种粒径微胶囊的D-柠檬烯保留率与时间的数据进行拟合，发现在不同相对湿度下D-柠檬烯的保留率遵循A rami方程[16]，从而得到粒径和湿度对D-柠檬烯的释放速率常数k以及释放机制参数n的关系(图2)。图2表明，D-柠檬烯的k随着相对湿度增加而增加，粒径最小的NP的k最低。低湿度环境下，随着相对湿度从25%增加到33%，SP和LP的k值分别增大5.1和6.4倍，而NP仅增加1.2倍。一般来说，在较低的湿度(相对湿度25%)条件下，基质仍然处于玻璃态，囊壁通透性很小[16]，水分子和柠檬烯分子保持较低的迁移率。随着相对湿度增加到33%，由于水分子的塑化作用，结构开始变化，处于高流动性状态[16]，分子迁移率增加，因此D-柠檬烯释放加快。当相对湿度从52%增加到75%，LP、SP和NP的k值增幅变小，分别为37%、19%和8%。这表明微胶囊由于水化作用，开始黏附形成高弹态(糊状)[25]，由于有效的表面积减少，促使D-柠檬烯的释放损失减少，因此释放速率增加缓慢。

a-释放速率常数;b-释放机制参数图2 不同粒径微胶囊中D-柠檬烯释放速率常数和释放机制参数Fig.2 Effect of particle size on the release rate constant and release mechanism factor of the D-limonene

理想条件下的微胶囊释放过程符合零级动力学方程(n=0)，即微胶囊的释放过程为恒速释放，但受诸多因素的影响，其实际释放过程很难实现零级释放[26]。图2表明，低湿度环境下(相对湿度25%～33%)，LP、SP和NP的n<1，这说明粉末中D-柠檬烯的释放可能介于扩散限制动力学和一级释放之间;而在较高的相对湿度时(75%)，n>1，说明随着相对湿度的升高，微胶囊释放速率呈增大趋势，因此在微胶囊贮藏过程中应对相对湿度进行严格控制。

为进一步探讨粒径和相对湿度对D-柠檬烯释放特性影响的机理，将3种微胶囊在37 ℃不同相对湿度进行平衡后，测定其Tg，结果见表2。

表2 不同粒径微胶囊的玻璃化转变温度 单位：℃

在低湿度环境下(相对湿度25%)，LP、SP和NP的Tg分别为62、88和100 ℃，具有显著的差异，且NP>SP>LP，说明粒径越小，Tg越高。食品体系中Tg容易受温度和水分含量变化的影响，在低温或低水分含量状态时，食品体系中的非晶体结构处于固态和玻璃态，几乎无分子运动。相对湿度25%时，微胶囊贮藏的温度(37 ℃)远低于Tg，体系处于玻璃态，从而D-柠檬烯释放受限，因此n<1。其中NP的Tg最高，因此其D-柠檬烯k以及n都是最小；而当相对湿度增加后，Tg逐渐下降，相对湿度为75%时,3种微胶囊的Tg无显著差异，都在42 ℃左右，与贮藏温度接近。当食品体系中的非晶体结构达到或接近Tg，其由无定形的玻璃态变化到更具渗透性的橡胶态，分子运动速度增加，导致体系中挥发性风味物质的扩散损失以及小分子如水、O2分子等的迁移[25]，因此3种粒径的微胶囊都具有最高的D-柠檬k、n值。

2.3 压片糖特征性风味成分分析

将3种微胶囊等量分别加入到压片糖，测定其特征风味成分，根据其总离子流色谱图(图3)，经NIST14.L谱库检索成分，按照峰面积归一化法计算所得组分的相对含量，结果如表3所示。可见，D-柠檬烯是压片糖的特征性风味成分，因此，后续可通过测定压片糖中D-柠檬烯含量探讨微胶囊粒径对其缓释释放的影响。

图3 压片糖中主要风味物质总离子流色谱图Fig.3 Total ion flow chromatogram of fla or compounds from pressed candy

表3 压片糖主要风味成分分析Table 3 The major olatile component analysis of pressed candy

2.4 粒径对压片糖中D-柠檬烯缓释性的影响

留香程度是压片糖质量好坏及消费者满意程度的评价标准之一，而这主要取决于其主要风味物质的缓释效果，一般来说，缓释时间越长则产品质量越好，反之越差。

研究表明，微胶囊的缓释与微胶囊的粒径、微球的壁厚和孔隙有关，也受到环境温度、水分和空气含量影响[27]。为比较不同粒径微胶囊缓释性的差异，将制备的3种甜橙味压片糖分别在水体系和酸体系中测定其D-柠檬烯含量的变化，结果见图4。在2种体系中，3种压片糖中风味成分释放程度受粒径影响不明显，在30 ℃下，80 min后基本已完全释放，表现出良好的缓释性。30 min内，S-NP中D-柠檬烯的释放速度最慢，缓释效果最好，表明压片糖中基体香精(甜橙油微胶囊)的粒径对产品中风味的释放会产生影响，基体粒径越小，其风味物质释放速度越慢，缓释效果越好。在酸体系中，30 min内D-柠檬烯释放量已达60%,而在水体系中释放量不到40%，说明在前期，压片糖在酸体系中能更快地释放。这可能是因为初期微胶囊壁材在酸性环境中受到破坏，芯材迅速释放，之后壁材会形成一种弹性膜，其机械强度增大，对芯材的释放起到一定的阻碍作用，从而形成控释[28]。

鉴于压片糖在口中停留时间通常低于10 min，为进一步对其风味释放机制进行探讨，通过对10 min内压片糖中D-柠檬烯的释放进行拟合(图5)，发现其符合Peppas-Sahlin模型(R2>0.98)，该模型常用于评价活性成分在系统结构中的Fickian和非Fickian扩散机制[29]，结果见表4。

a-水体系; b-酸体系图4 三种压片糖在模拟体系下D-柠檬烯含量变化Fig.4 The release of D-limonene in simulated model system

a-S-LP; b-S-SP; c-S-NP图5 三种压片糖10 min内在模拟体系中D-柠檬烯含量变化Fig.5 The release of D-limonene in simulated model system in 10 min

水体系中，3种压片糖的模型|k1/k2|>1，表明D-柠檬烯的释放都遵循扩散释放机制，粒径未造成差异，这可能与所用壁材亲水性有关[23]；酸体系中，S-LP的模型|k1/k2|<1，D-柠檬烯呈侵蚀释放机制，但S-SP和S-NP压片糖的模型|k1/k2|>1，D-柠檬烯呈扩散释放机制，说明粒径大小会对释放机制产生影响。WU等[30]研究发现，微胶囊表面的平滑度、粒径大小会影响壁材溶胀时间和程度，从而造成芯材释放通道、速度差异，导致其机制不同[31]。

3 结论

本文研究了粒径对甜橙油微胶囊中主要风味物质D-柠檬烯在贮藏以及模拟食品体系中释放特性的影响。结果表明，在37 ℃不同相对湿度条件下贮藏5周的加速实验，发现在低湿度条件下(相对湿度25%)，3种粒径的微胶囊都具有较稳定的D-柠檬烯保留率。而当湿度越高时(相对湿度75%)，粒径越小，则D-柠檬烯保留率越高。NP经5周后，其D-柠檬烯的保留率至少有86%，而LP和SP保留率可分别降到71.3%和83.4%(相对湿度75%)。

进一步对加速实验中D-柠檬烯的释放进行A rami公式拟合，结果表明，D-柠檬烯的释放速率k随着相对湿度增加而增加，粒径最小的NP具有最低速率常数。低湿度环境下(相对湿度25%～33%)，LP、SP和NP中D-柠檬烯的释放可能介于扩散限制动力学和一级释放之间，D-柠檬烯的分子扩散速度受限；而当相对湿度增大到75%，n>1，表明D-柠檬烯释放速率随着时间加快。这可能是因为3种粒径微胶囊具有不同的Tg。在低湿度环境下(相对湿度25%)，Tg有显著的差异，且NP>SP>LP，说明粒径越小，Tg越高。而当相对湿度增加后，其差异减小，相对湿度75%时，Tg都在42 ℃左右，三者没有显著Tg差异。

在2种模拟食品体系中，在30 ℃下，压片糖中D-柠檬烯的释放于 80 min后基本已完全释放，表现出良好的缓释性，但压片糖在酸体系30 min内中释放较快。通过对10 min内压片糖中D-柠檬烯释放曲线进一步进行释放动力学分析，发现其符合Peppas-Sahlin模型，水体系中，3种粒径微胶囊对风味物质的释放都遵循扩散释放机制；酸体系中，粒径会对释放机制产生影响，S-LP中D-柠檬烯呈侵蚀释放机制，但在S-SP和S-NP中呈扩散释放机制。