血小板内皮黏附分子-1与表皮生长因子受体在乳腺浸润性导管癌中表达的关系及意义

司惠妍，李靖若，吕思琦，李文龙，张莹莹

(郑州大学第一附属医院 乳腺外科，河南 郑州 450052)

如今，乳腺癌已成为威胁我国女性健康的首位恶性肿瘤，发病率连年上升，发病年龄趋于年轻化，乳腺恶性肿瘤是乳腺上皮细胞在多种因素的共同作用下异常增殖而最终形成的。对乳腺癌组织进行免疫组化检测及分析是目前乳腺癌诊疗的基本步骤之一，它影响着进一步治疗方案的制定以及预后的判定。临床研究发现，血小板-内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又称CD31)是相对分子质量为130 kD的免疫球蛋白超家族成员之一，主要存在于血管内皮细胞的紧密连接处，与内皮细胞的生物学功能密切相关，它参与了细胞的黏附、外渗，影响着多种信号通路的表达。另外，CD31也影响了肿瘤细胞与细胞外基质中整合素的结合，抑制乳腺癌细胞的凋亡[1]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是相对分子质量为180 kD的酪氨酸激酶受体家族成员之一，常存在于细胞膜表面，有酪氨酸激酶活性，影响细胞外信号向胞内传递的过程，刺激乳腺癌细胞分裂增殖[2]。近年来一些研究发现CD31和EGFR在乳腺癌组织中异常表达，但有关二者之间联系的文献却很少[3-4]。本研究通过免疫组织化学方法检测乳腺癌组织中CD31与EGFR表达情况，探讨它们与乳腺癌分子分型、细胞增殖核抗原(Ki-67)的表达及其他生物学行为之间的关系，为乳腺癌的诊疗及判断预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择2017年10月至2019年10月间就诊于郑州大学第一附属医院乳腺外科原发性乳腺癌患者163例，术后病理均为乳腺浸润性导管癌，患者均为女性，年龄为27～83岁，中位年龄为50岁。术前均未接受化疗、放射治疗及内分泌治疗。按照美国癌症联合委员会于2017年发布的乳腺癌TNM分期标准，分为Ⅰ期56例，Ⅱ期95例，Ⅲ期11例，Ⅳ期1例；肿瘤直径>2 cm有79例，≤2 cm有84例；淋巴结转移73例，无转移90例。参照中国临床肿瘤协会于2019年发布的乳腺癌分子分型标准，分为Luminal A型41例，Luminal B型41例，三阴型40例，Her-2阳性型41例。Ki-67<30% 74 例，Ki-67≥30% 89例。

1.2 试剂鼠抗人CD31单克隆抗体(66065-1-Ig)、鼠抗人EGFR单克隆抗体(66455-1-Ig)均购自武汉三鹰公司，Ki-67增殖检测试剂盒、SP超敏免疫组化试剂盒、DAB显色剂均购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.3 方法163例乳腺浸润性导管癌患者均接受手术治疗，利用免疫组织化学SP染色方法检测术中获取的乳腺癌组织中CD31、EGFR及Ki-67表达情况。首先将标本置于中性甲醛固定，后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，烤片。石蜡常规脱蜡水化，用PBS缓冲液冲洗3次，柠檬酸钠抗原修复液修复，过氧化氢溶液消除内源性过氧化物酶活性，滴加正常山羊血清封闭液，室温静置20 min，甩去多余液体。滴加Ⅰ抗50 μL，室温静置1 h，滴加鼠抗人CD31抗体及鼠抗人EGFR抗体室温下孵育30 min。进行DAB显色8～12 min后用蒸馏水冲洗，脱水、透明、以中性树胶封固，镜下观察。阴性对照以磷酸盐缓冲液PBS代替一抗，阳性对照为同样条件下已知的阳性切片。

1.4 结果判定CD31及EGFR阳性表达为在组织中出现棕黄色染色，即在高倍镜(×200)下随机取5个不同的视野，观察染色数量及程度，CD31、EGFR染色阳性细胞数>10%为阳性表达。

1.5 统计学分析数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，定性资料采用χ2检验，相关性分析使用Spearman秩相关，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 乳腺浸润性导管癌组织中CD31与EGFR蛋白表达及二者的关系163例乳腺癌组织中，共有91例CD31表达阳性(55.8%)，棕黄色颗粒主要定位于血管内皮的细胞质和细胞膜处，66例EGFR表达阳性(40.5%)，棕黄色颗粒主要定位于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜。二者阳性表达呈正相关(r=0.155，P<0.05)。见图1。

2.2 乳腺浸润性导管癌组织中CD31、EGFR蛋白表达阳性率与临床生物学特征的关系CD31阳性淋巴结转移率较CD31阴性高，CD31在Ki-67≥30%、三阴型组织中阳性表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR蛋白在肿块最大径>2 cm、组织学分型Ⅲ级、Ki-67≥30%、三阴型组织中阳性表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

A为CD31在乳腺浸润性导管癌组织中的表达；B为EGFR在乳腺浸润性导管癌组织中的表达；CD31为血小板内皮细胞黏附因子-1；EGFR为表皮生长因子受体。

图1 CD31和EGFR在乳腺浸润性导管癌组织中的表达(DAB，×200) 表1 乳腺癌组织中CD31、EGFR阳性表达率与临床生物学特征的关系[n(%)]

3 讨论

乳腺肿瘤细胞的生长发育是在多种因素的共同作用下完成的，而乳腺肿瘤血管的生成是乳腺癌细胞增殖分化、复发转移的重要影响因素之一。CD31参与并调节了血管内皮细胞的病理活动，当血小板与肿瘤细胞结合后，内皮细胞与CD31连接，促使并增强内皮细胞与乳腺肿瘤细胞的粘连[5]。另外，CD31常与其他黏附分子共同被激活，产生大量生长因子降解微血管膜，使乳腺肿瘤细胞开始浸润并移动，乳腺癌组织周围新生血管生成，最终促进肿瘤细胞增殖、浸润并迁移[6]。在以往的研究中，CD31作为血管内皮标志物，可以反映前列腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌等恶性肿瘤的生长发育，为它们确定诊疗方法、判断预后做出巨大贡献。Bergom等[7-10]研究指出，胃肠道间质瘤的增殖发展及预后与CD31表达有关。在本研究中，CD31蛋白在淋巴结有转移、Ki-67高表达、三阴型的组织中阳性表达较高。乳腺癌的常见转移方式有局部浸润、淋巴结转移、血液转移，而淋巴结转移在临床中最为多见。实验结果表明，CD31与乳腺癌肿瘤的发生发展及转移密切相关，并且这一过程需要来自周围新生血管的营养支持，CD31阳性表达，乳腺癌肿瘤临床分期可能越晚。另外，既往研究显示，三阴型乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2均为阴性的乳腺癌，其分化程度较低，复发转移率及恶性程度较高，患者总体存活时间较短。本研究结果提示了新生血管的形成及CD31阳性表达与乳腺癌组织的分子分型和三阴型乳腺癌的上述特点相关。

EGFR是酪氨酸激酶Ⅰ型受体家族成员之一，有酪氨酸激酶活性，主要通过基因突变或者基因扩增两种方式激活，其活化、表达、突变对于肿瘤细胞的生长发育、变异凋亡和周围新生血管的形成有着重要的作用[11]，EGFR蛋白表达及信号通路的增强也提示了乳腺肿瘤的预后不良[12-13]。本研究中，EGFR蛋白在较大肿块、组织学分型较高、Ki-67高表达、三阴型组织中阳性表达率较高，说明有着酪氨酸激酶作用特点的EGFR，在乳腺癌肿瘤尤其是三阴型乳腺癌的生长发育及分化进程中起重要作用，EGFR阳性表达，肿瘤越大，分期越晚。

在本研究中，CD31和EGFR在乳腺癌组织特别是三阴型乳腺癌组织中高表达，统计学数据表明二者之间有一定的相关性，说明在乳腺浸润性导管癌新生血管的形成及肿瘤的生发转移过程中CD31与EGFR密不可分，互相促进，相辅相成，协同作用，但其机制还有待进一步研究。乳腺肿瘤细胞的增殖代谢、迁移转移涉及多个基因的改变，EGFR和CD31这两种蛋白则可作为判断乳腺癌生长发育程度、侵袭转移的标志物，对临床诊断及判定预后有着重要指导作用，也可成为今后临床治疗尤其是靶向治疗的新方向。