多杀菌素影响下黑斑侧褶蛙皮肤转录组分析

王爱丽 李娜 王金园 聂茂菊

（潍坊科技学院，山东寿光 262700）

0 引言

多杀菌素（Spinosad），又名刺糖菌素，是由好氧型革兰氏阳性土壤放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵液中提取的一种大环内酯类无公害高效生物杀虫剂，没有抑菌活性，但有杀虫活性。其具有独特的杀虫机理，能够有效地防治各种害虫，且无交叉抗性，对大多非靶标动物都有极高的安全性等优点，且多杀菌素可较快地通过光和土壤微生物降解，因而不会造成环境风险。由于多杀菌素具有上述优点，所以，多杀菌素在蔬菜种植区应用广泛[1]。

黑斑侧褶蛙（Pelophylax nigromaculata），又名黑斑蛙，属无尾目，蛙科，侧褶蛙属，是山东寿光地区常见蛙类之一。因其清晨及夜间大量捕食斜纹夜蛾、蝼蛄、金花虫等昆虫，而成为经济价值较大的蛙类之一[2]。黑斑侧褶蛙水陆两生环境复杂，对环境的依赖性大，环境的变化对他们的生长和进化都会产生很大的影响。本文拟对经过多杀菌素处理的皮肤组织进行转录组分析，找出差异基因显著富集的通路，预测多杀菌素对黑斑侧褶蛙皮肤的功能影响。

1 材料和方法

1.1 样品处理和RNA 提取

本试验样品采集于山东省烟台市昆嵛山。黑斑侧褶蛙10 只分成2 组，每组5 只标记养殖，其中对照组标记为c，处理组标记为n。处理组为用2.5%悬浮剂50 ～100 毫升稀释多杀菌素溶液喷雾进行刺激的黑斑侧褶蛙。对照组和处理组在完全相同的环境中生长，48 小时后捣毁脊髓法处理，取背部中央皮肤液氮保存备用。分别测定6 只黑斑侧褶蛙皮肤转录组信息，序列比对，差异基因，差异抗菌肽分析。同时确定黑斑侧褶蛙转录组序列发生改变的多杀菌素浓度为有效刺 激 浓 度。总RNA 用TRIzol（Invitgen，Carlsbad，CA，USA） 试 剂 提 取，260/280nm（A260/A280）和Agilent BioAnalyzer 2100（Agilent，上海，中国）测量吸光度来检测RNA 样品的完整性和质量。

李伟：顺丰的并购逻辑其实很简单，就是看顺丰的市场战略方向在哪里。像冷链、快运、航空快递都是顺丰的市场战略，因为顺丰的并购也在这几个方向上。如果再剖析一下，我认为有2个点很关键。

看着家里的气氛越来越紧张，儿子儿媳妇也很着急，可工作太忙没办法分担，就想着早点给宝宝送去幼儿园，这样也能让我和老伴缓缓。我知道后第一个举手赞同，可老伴不干，心疼小孙子太小，到幼儿园挨欺负。儿子儿媳妇说没关系，我也说得锻炼锻炼，可无论我们怎么劝，老伴也不让送，她一点也不考虑自己，更没有考虑我的感受。

1.2 文库的构建

（四）历史悠久的巴渝文化。西沱镇是一个历史悠久的文化古镇，形成了长江上游独特的巴文化，分布着商周时期的观音寺遗址、沙湾遗址等，有土家族风格的吊脚楼群与汉族传统风格的古建筑群组成的云梯街。2003年11月被评为首批“中国历史文化名镇”，2008年被评选为“巴渝新十二景”之一。

1.3 测序数据质量控制与分析

总之，采用“产-教-学”深度融合的教学模式，充分调动起企业、教师、学生参与积极性，让学生在校期间即可实现“学生-准职业人-职业人”的身份转变，解决学生就业与企业的衔接问题，实现多方共赢的人才培养模式与校企合作培养模式。

1.4 DEGs 的筛选

对ORF 同Uniprot 数据库比对结果，基因注释到Uniprot、NR、NT 的 基 因 数 进 行 统 计。ORF 同Uniprot 数据库共比对到比对18217 条结果，基因从NR 数据库比对到32512 条基因，基因从NT 数据库比对25821 条基因，从Uniprot 数据库的比对结到25084 条基因。各数据库共同注释基因数为10945 条。

1.5 DEGs 表达模式的聚类分析

将差异表达的转录本映射到KEGG 数据库（www.genome.jp/KEGG/） 进 行KEGG pathway 分 析， 该分析与数据进行GO 分析的方法相同。在KEGG 通路的分析中，使用经过FDR 校准后的Q 值作为筛选标准，Q ≤0.05 的通路被认定为显著富集通路。

1.6 GO 和KEGG pathway 功能富集分析DEGs 表达模式的聚类分析

6 个的皮肤cDNA 文库测序共获得273945858 个raw reads。筛选获得266625548 个clean reads，占所有样品序列总数的98%以上。

转录本使用软件Trinity 进行组装得到同源的和（或）可变剪接形式的转录本。基于过滤后的Clean Data，用Trinity 组装出全长转录本序列，并基于转录本序列，取每个基因中最长的转录本序列作为Unigene。利用Bowtie2（2.2.3 版）将用于组装的序列与组装后的转录本序列进行比对，使其定位到组装转录本，然后统计比对上序列的Reads 比例。采用序列比对的方法对Trinity 组装得到的全部转录本和Unigene 分别进行BUSCO 评估，核心蛋白比对率评估，准确性评估，注释比例评估，Reads 利用率评估，利TransDecoder软件进行开放阅读框预测，然后基于Trinity 组装的Unigene 序列和TransDecoder 预测得到的ORF 序列，通过Blast、HmmScan、SignalP、TmHMMP 等工具得到组装结果在相应数据库中的注释信息，然后采用Trinotate（Trinotate Release v3.0.2）整合得到综合的功能注释结果。

将总RNA 随机切割成短片段，以片段RNA 为模板合成具有随机六聚体的第一链cDNA，然后加入缓冲dNTPs（dUTP 而 不 是dTTP），RnaseH， 用DNA 聚合酶Ⅰ合成第二链cDNA，用QiaQuick PCR 试剂盒纯化，用EB 缓冲液洗脱。末端修复，碱基A 加上测序连接物，然后通过UNG（Uracil-N-Glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶）链降解，连接产物通过PCR 扩增进行逆转录，产物富集生成cDNA 文库，并使用Gene Denovo Biotechnology Co.的Illumina HiSeqTM 4000 进行测序。（中国广州）

根据差异表达基因在每个样品里的表达量，取以2 为底的对数后，计算欧氏距离，利用R 软件（3.1.1版），对不同样本的差异表达基因进行分层聚类分析。

2 实验结果

2.1 测序数据汇总

使 用R package clusterProfiler 进 行GO terms 和KEGG pathways 富集分析。将差异表达的转录本富集到GO 数 据 库（http://www.geneontology.org/）， 并计算每个术语的富集数，以获得具有特定GO term 的转录本列表和富集数。

2.2 注释结果

使用RPKM 估计基因表达值，使用DESeq2 对对照组和处理组之间的mRNA 进行差异表达分析。以q值和log2差异倍数作为标准进行差异表达转录本的筛选，阈值为|log2Ratio|≥1 和q＜0.05。

2.3 DEGs 基因的鉴定和分析

通过对DEGs 分析发现，对照组与处理组之间有1695 个差异表达基因，其中上调基因737 条，下调基因958 条。各小组差异基因聚类效果较好，可用于下一步的数据分析。

2.4 GO and KEGG pathway 分析

对DGEs 进行GO 和KEGG 富集分析，以进一步确认它们参与生物过程调控的功能。GO 分析结果显示c-vs-n 差异基因富集结果中，得到4377 个GO 分类。contractile fiber part、myosin filament、Z disc是细胞组分Ontology 最显著富集的三个通路。muscle contraction、muscle system process、striated muscle contraction 是生物过程Ontology 最显著富集的三个通路。structural constituent of muscle 是分子功能Ontology 富集显著程度最高的GO 条目。

KEGG 通路分析显示，显著富集的前4 条KEGG 通路分别是Antigen processing and presentation、Estrogen signaling pathway、IL-17 signaling pathway和MAPK signaling pathway，在这四条通路中Hsp70和Hsp90 均显著上调。

与干预前比较，住院规培医师采用萨提亚心理治疗模式干预后SES总分升高，差异具有统计学意义（t=12.34，P＜0.05）；干预前后人际关系困扰得分比较，差异具有统计学意义（t=11.41，P＜0.05）（见表1）。

3 讨论

随着农药使用量的逐年增加，农药污染日益严重。生物化合物多杀菌素常用于农业和有机农业中以对抗害虫[3]。全球两栖类动物种群衰退现象十分严重，黑斑侧褶蛙是寿光地区常见的两栖动物，有研究证明这些年来，黑斑蛙的数量急剧减少[4]。

对照组和处理组差异基因显著富集到muscle contraction、structural constituent of muscle 等条目中。而显著富集的KEGG 通路则有四个，其中基因Hsp70、Hsp90 和IL-17 均上调。Hsp70、Hsp90 是一种热休克蛋白，在应激条件下表达明显增加[5]。IL-17 是T 细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，与受体结合，通过MAP 激酶途径和核转录因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途径发挥生物学作用[6]。我们预测多杀菌素的处理引起黑斑侧褶皮肤细胞产生应激反应，诱导免疫相关因子表达水平的提高，从而提高了黑斑侧褶蛙皮肤对外界农药刺激的免疫反应。