LncRNA NEAT1和LncRNA-MIAT在老年急性心肌梗死外周血中的表达及临床意义

郭 俊，徐 利，郭 淼，钟 慧，吴 敏

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死[1-2]。AMI高发于老年人，每年新发至少50万例，近年来随着我国老龄化人口加剧，AMI发病率呈上升趋势，且病死率、致残率极高，严重威胁老年人生命健康[3-5]。早期正确诊断AMI对提高患者生存率和改善预后非常重要，目前心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I， cTnI)是临床广泛应用于诊断AMI的血清标志物，但其易受心力衰竭、心房颤动及其他严重慢性心脏病等影响，造成AMI诊断假阳性[6-7]。因此寻找早期诊断AMI敏感特异的新型标志物是目前临床研究的方向。多种长链非编码RNA(long non-coding RNA， LncRNA)在心肌组织中特异性表达，与心肌重构、心功能等密切相关，有可能成为心脏发育和疾病相关的新型靶向标志物[8-9]。研究报道，LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT与多种癌症发生发展有关[10-11]，且均在炎性因子介导的炎症反应中发挥促炎作用[12-14]，但关于LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT在AMI中的作用尚鲜有研究。因此本研究拟检测老年AMI患者血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT表达水平，以探究其对AMI的预测价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取我院2017年10月—2019年9月本院收治的老年AMI患者75例为AMI组，另取同期门诊体检健康老年人75例为对照组。AMI组男42例，女33例；年龄60～81(71.32±9.67)岁；高血压43例，糖尿病41例，吸烟35例。对照组男39例，女36例；年龄60～81(70.84±9.51)岁。2组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会批准通过，所有样品采集及资料调查均取得患者及其家属知情同意并签字确认，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2纳入与排除标准 ①纳入标准：患者均符合AMI诊断标准[15]；年龄≥60周岁； 发病12 h内住院并已完成采血；住院前未接受任何相关治疗；临床资料完整。②排除标准：合并肝、肾等重要脏器功能障碍者；合并恶性肿瘤、其他慢性疾病、神经运动系统疾病或心源性休克者；心脏病史、严重心律失常或血液传染性疾病者；住院期间合并严重并发症者。

1.3主要试剂及仪器 Trizol试剂(货号：R0016)购自上海碧云天生物技术研究所；第一链cDNA合成试剂盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，货号：6210A)、TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)试剂盒(货号：RR820A)购自大连TaKaRa生物公司；人cTnI ELISA试剂盒(货号：MA1-20117)购自美国Invitrogen公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成；紫外分光光度计购自美国Thermo公司；7500型RT-qPCR仪购自美国Bio-Rad公司等；DXC600全自动生化仪购自美国贝克曼库尔特公司。

1.4方法

1.4.1血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平检测：发病12 h内采集AMI组及对照组纳入者肘静脉外周血2份，每份3 ml，3500 r/min，有效离心半径10 cm，离心10 min，分离血清置于-80℃冰箱待检。采用Trizol提取血清总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA 浓度及纯度，A260/A280为1.8～2.0可用于下游试验。反转录获得模板cDNA，置于-20℃保存备用。采用RT-qPCR检测LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT表达水平。RT-qPCR采用20 μl反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反应条件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40个循环；添加溶解曲线。LncRNA NEAT1上游引物序列5′-CAATGACTTGGGGATGATGCAAACAATTACTG-3′，下游引物序列5′-GTACTCCCCACCTACACACCCAC-3′；LncRNA-MIAT上游引物序列5′-TACAGTACTGTGAUAACTGAA-3′，下游引物序列5′-CAGTTATCAGTACT-3′；GTATT及内参GAPDH上游引物序列5′-GTCGATGGCTAGTCGTAGCATCGAT-3′，下游引物序列5′-TGCTAGCTGGCATGCCCGATCGATC-3′。采用2-ΔΔCt法对血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT相对表达水平进行定量分析。

1.4.2血清心肌酶谱水平检测：采用ELISA检测纳入者血清cTnI水平，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用DXC600全自动生化仪检测血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，其正常参考范围分别为血清cTnI：0～0.2 μg/L；CK：24～170 U/L；CK-MB：0～25 U/L。

2 结果

2.1血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平比较 AMI组血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平均显著高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 2组血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平比较

2.2血清cTnI、CK、CK-MB水平比较 与对照组比较，AMI组血清cTnI、CK-MB水平显著升高(P<0.01)，但2组CK水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组血清心肌酶谱cTnI、CK、CK-MB水平比较

2.3AMI患者血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT与CK-MB、cTnI相关性分析 AMI患者血清LncRNA NEAT1与LncRNA-MIAT水平呈正相关(P<0.01)，且LncRNA NEAT1和LncRNA-MIAT均与CK-MB、cTnI水平呈正相关(P<0.01)。见表3。

表3 AMI患者血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT与CK-MB、cTnI相关性

2.4血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平对AMI发生的预测价值分析 以血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平及二者联合检测为检验变量，绘制ROC曲线，AUC间比较采用DeLong等[16]提出的方法。血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT单独预测AMI发生的AUC分别为0.884、0.801，LncRNA NEAT1≥2.00预测AMI发生的灵敏度为77.30%，特异度为92.00%；LncRNA-MIAT≥1.40预测AMI发生的灵敏度为77.30%，特异度为86.70%。二者联合检测时AUC、灵敏度、特异度均显著提高(P<0.01)。见图1、表4。

图1 血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平预测AMI发生的ROC曲线AMI为急性心肌梗死,LncRNA为长链非编码RNA，ROC为受试者工作特征曲线

表4 血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平对AMI发生的预测价值分析

3 讨论

冠状动脉粥样硬化是AMI的发病基础，冠状动脉内不稳定性斑块破裂后，血小板发生活化，激发凝血级联反应使血液处于高凝状态，形成栓塞造成心肌缺血、心肌损伤坏死,亦可诱发机体炎症和免疫反应，造成心肌细胞免疫损伤[16]。寻找与心肌细胞凋亡相关的生物标志分子有助于AMI的临床诊断。CK-MB主要分布在心肌，血清CK-MB水平在心肌损伤后2～12 h急剧上升，一般持续2～3 d，是临床常用诊断心肌损伤的指标之一。cTnI是肌钙蛋白的一个亚型，特异存在于心肌细胞的细肌丝上，心肌损伤后释放入血且存在时间长，是临床诊断AMI常用的特异生物学标志物[8,17]。本研究结果显示，与对照组比较，AMI组血清CK-MB、cTnI水平显著升高，提示AMI患者存在CK-MB、cTnI水平升高，可能发生心肌损伤或坏死。但CK-MB、cTnI升高还见于其他任何导致心肌细胞损伤或通透性改变的疾病和病理状态，因此仅检测血清CK-MB、cTnI水平易使AMI诊断的假阳性率增加。

LncRNA是一类长度超多200个核苷酸的非编码RNA，具有多种生物学功能，与基因的表达、转录、翻译关系密切，在人体生长、代谢、疾病及细胞周期、凋亡中亦发挥重要作用[18-19]。研究证实，多种LncRNA可在心肌组织中特异性表达，成为心脏发育及疾病相关独特的检测分子[20-21]。韩虎魁等[17]研究报道，与对照组比较，AMI患者血清中LncRNA AK057321水平在AMI发作2 h内开始升高，6 h到达高峰后呈下降趋势，但2～4 d内依然高于正常对照组，且与CK-MB及cTnI呈正相关。关于血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT与AMI直接相关的研究尚鲜有报道。黄舒颖等[22]报道，与空白RAW264.7巨噬细胞比较，结核分枝杆菌H37Rv感染的RAW264.7巨噬细胞中LncRNA NEAT1及白介素(IL)-6水平显著升高，沉默LncRNA NEAT1后，IL-6水平下降。Shui等[13]认为，LncRNA NEAT1可调节poly(I∶C)诱导的IL-8表达，还可选择性调控Toll样受体2(TLR2)信号通路下游细胞因子IL-6、CCL2等表达，但对肿瘤坏死因子(TNF)-α水平无显著影响。Tan等[23]报道，与对照组比较，冠心病患者血清LncRNA-MIAT水平显著升高，且与血清IL-6、TNF-α水平呈正相关。任成龙等[12]研究报道，血管内皮细胞中LncRNA-MIAT水平随TNF-α刺激时间及浓度增加而升高，LncRNA-MIAT可能参与血管内皮细胞炎症反应。Li等[24]研究报道，LncRNA-MIAT可通过靶向miR-93调控TLR4进而激活PI3K/Akt/mTOR 通路导致心肌肥厚。本研究结果显示，与对照组比较，AMI组血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平显著升高，提示LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT可能通过介导炎症反应，与AMI发生有关。本研究结果还显示，血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平与CK-MB、 cTnI均呈正相关，提示血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT可能通过介导炎症反应促进AMI心肌损伤。

本研究结果显示，血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT单独预测AMI发生的AUC分别为0.884、0.801，LncRNA NEAT1≥2.00预测AMI发生的灵敏度为77.30%，特异度为92.00%；LncRNA-MIAT≥1.40预测AMI发生的的灵敏度为77.30%，特异度为86.70%。二者联合检测时AUC、灵敏度、特异度均显著提高。提示联合检测血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平可能对AMI早期诊断有一定预测价值。

综上所述，LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT在AMI患者血清中高表达，可能与AMI患者心肌损伤有关，二者联合检测对AMI发生有一定预测价值。但由于本研究样本量少，存在不足；另外关于LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT参与AMI具体机制及相关通路尚不清楚，后期有待进一步大样本量深入探究。