Cx43和ET-1在食管鳞癌组织中的表达及意义

尹辉，夏迎晨，喻本桐，刘燕隔，查建华，刘宝治，胡智

1南昌大学第一附属医院，南昌330006；2南昌大学 基础医学院；3武冈市人民医院

食管鳞癌(ESCC)是常见的消化系统恶性肿瘤之一，诊断明确后多为肿瘤晚期[1]。中国是世界食管癌高发的国家，而ESCC约占食管癌患病总数的90%。缝隙连接蛋白43(Cx43)构成的缝隙连接作为相邻细胞间膜通道结构，通过缝隙连接通信相邻细胞进行信息和能量传递，对细胞的增殖和分化及机体内环境的平衡起调节作用[2]。内皮素-1(ET-1)是一种可与G蛋白偶联家族ETAR和ETBR两种受体结合发挥作用的活性多肽[3]。我们采用免疫组化法检测ESCC组织中Cx43和ET-1的表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年12月—2014年12月南昌大学第一附属医院行食管鳞癌根治手术切除并经病理检查证实ESCC的病理标本118例。患者术前均未行放化疗治疗，男77例、女41例，年龄45～75(60±15)岁。肿瘤直径≤3 cm 54例，>3 cm 64例；高分化型33例，中分化型40例，低分化型45例；浸润深度：T1+T2期68例，T3+T4期50例；淋巴结转移48例，未转移70例。同时选取118例相应癌旁正常组织(距离癌组织5 cm以上)标本作为对照。本研究通过南昌大学第一附属医院伦理委员会批准。患者或其家属签署知情同意书。1.2 ESCC组织及癌旁正常组织中Cx43、ET-1表达检测 采用免疫组化法。离体标本以10%中性甲醛固定，常规行石蜡包埋，切片，经二甲苯脱蜡，再梯度乙醇水化；室温下3% H2O2-甲醇溶液中孵育15 min；微波进行组织抗原修复后用PBS冲洗3 min×3次；滴加一抗4 ℃冰箱过夜；加入二抗室温下孵育20 min后PBS冲洗3次；DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；光镜观察。PBS溶液替代一抗作为空白对照，已知的阳性切片标本作阳性对照。Cx43染色判断标准参照文献[4]方法，在光镜高倍镜下，阳性定位于细胞膜或细胞质，显示棕黄色。结果以阳性细胞率结合染色强度进行分级评分，以两指标得分的乘积判定，0～1分为-，2～4分为+，5～8分为++，9～12分为+++。其中-～+为低表达，++～+++为高表达。

ET-1染色评价标准参照文献[5]方法，ET-1阳性表现为细胞质染色棕黄色或棕褐色者。结果以阳性细胞率结合染色强度进行分级评分，两分数相加<2分为-，2～3分为+，4～5分为++,6分为+++。其中-～+为低表达，++～+++为高表达。

1.3 随访 通过电话或门诊方式对患者进行随访，随访时间为手术当日起至末次随访时间或死亡，截至2014年12月1日。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料采用χ2检验或连续性校正χ2检验或Fisher确切概率检验，双变量资料相关分析选择Spearman等级相关性分析，用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，用Log-rank检验其差异性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC组织及癌旁正常组织中Cx43、ET-1表达比较 ESCC组织中CX43表达-、+、++、+++分别为24、59、23、12例，Cx43高表达率为29.66%(35/118)；癌旁组织中CX43表达-、+、++、+++分别为12、44、34、28例，Cx43高表达率为52.54%(62/118)。ESCC组织中ET-1表达-、+、++、+++分别为18、37、41、22例，ET-1高表达率为53.38%(63/118)；癌旁组织中ET-1表达-、+、++、+++分别为34、46、25、13例，ET-1高表达率为32.00%(38/118)。癌旁正常组织及ESCC组织中Cx43、ET-1表达差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 Cx43、ET-1表达与ESCC患者临床病理特征的关系 CX43表达与患者年龄、性别、肿瘤直径无关(P均>0.05)，与肿瘤分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关(P均<0.05)。ET-1表达与患者年龄、性别、肿瘤直径无关(P均>0.05)，与浸润深度、淋巴结转移、分化程度有关(P均<0.05)。见表1。

表1 Cx43、ET-1表达与ESCC患者临床病理特征的关系(例)

2.3 ESCC组织中Cx43和ET-1蛋白表达的关系 ESCC组织中ET-1低表达者Cx43高表达22例，低表达33例；ET-1高表达者Cx43高表达13例，低表达50例，Spearman等级相关性分析结果显示，ESCC内Cx43和ET-1表达呈负相关(r=-0.211，P<0.05)。

2.4 CX43和ET-1表达与食管鳞癌患者5年生存率的关系 纳入生存分析的ESCC患者中ET-1低表达55例，高表达63例，整体失访率分别为20.3%；纳入生存分析的ESCC患者中Cx43低表达83例，高表达35例，整体失访率分别为19.5%。Cx43高表达者5年生存率高于Cx43低表达者(χ2=8.852，P<0.05)；ET-1低表达者5年生存率高于ET-1高表达者(χ2=9.855，P<0.05)。

3 讨论

Cx43是间隙连接蛋白(Cx)家族的主要成员之一，主要表达于心肌组织、成纤维细胞、上皮细胞等多种组织，可作为缝隙连接结构和功能的基础[6]。Cx43是一种抑癌基因，与恶性肿瘤的发生关系密切，恶性肿瘤中Cx基因被抑制，常处于失活状态，随着Cx43表达下降和缺失，可造成连接通信功能减退，影响细胞间信号传递、增殖分化，从而导致人体内环境紊乱，使得肿瘤细胞发生恶性演变[7,8]。研究显示，通过恢复Cx43表达和重建功能性间隙连接通信，可在肿瘤治疗方面起到明显效果。除此以外，通过间隙连接通信从而实现细胞的旁观者效应亦可能成为Cx肿瘤治疗的方式之一[9]。高飞等[10]应用免疫组化法发现，Cx43在骨肉瘤组织中的表达低于骨肉瘤旁正常组织。Lee等[11]发现，利用基因转染技术诱导Cx基因表达后可明显抑制转化细胞的生长和肿瘤形成。李建玲等[12]利用免疫组织化学法发现，Cx43表达于胃癌和正常胃组织中，Cx43的染色强度及阳性率随着分化程度下降而呈现出降低趋势，说明Cx43低表达可能与胃癌发展演变存在一定关系。本实验结果显示，食管鳞癌组织中Cx43的高表达率(29.66%)低于癌旁正常食管组织(52.54%)，与上述结果基本一致。随着食管鳞癌分化程度增加、浸润深度加深、淋巴结转移，Cx43在食管鳞癌组织中的表达呈降低趋势。本实验对118例食管鳞癌患者5年生存率的分析结果显示，食管鳞癌中Cx43低表达的患者，其5年生存率低于Cx43高表达者。这均可进一步证明Cx43的抑癌功能；Cx43表达异常，可引起间隙连接蛋白改变从而造成通信中断，这可能与肿瘤发生发展密切相关，具体发病机制仍需进一步探讨研究，Cx43有望应用于临床诊断并可成为开发特异性影响细胞间通信的化学工具和药物治疗靶点。

ET-1是21个氨基酸组成的具有血管收缩功能的生物活性多肽，主要由内皮素细胞、血管平滑肌细胞及表皮细胞合成。人类ET存在ET-1、ET-2、ET-3三种基因表达，加上ETAR和ETBR两种内皮素受体，统称为内皮素轴[13]。其中，ET-1生物学活性最强，在多个器官系统疾病及多种肿瘤的发生发展中具有重要作用，是近年来研究热点[14]。ET-1除了血管收缩功能外，还具有刺激多种癌细胞生长的功能，促进某些恶性肿瘤发生发展[15]。本研究结果显示，ET-1在食管鳞癌组织中的高表达率高于癌旁正常组织，差异有统计学意义，与Ishimoto等[16]结果相符。另外，本实验结果显示，ET-1表达与食管鳞癌组织分化程度、浸润深度和淋巴结转移有关。食管鳞癌中ET-1高表达者5年生存率低于ET-1低表达者，表明ET-1参与了食管鳞癌的侵袭转移。ET-1可通过影响Cx43基因表达从而减弱细胞间缝隙连接，造成肿瘤细胞发展演变。本实验结果显示，Cx43和ET-1在食管鳞癌组织中的表达呈负相关，表明食管鳞癌组织中Cx43减少或缺失、ET-1过表达与肿瘤的浸润转移密切相关。

总之，Cx43在食管鳞癌中呈低表达，ET-1呈高表达，检测二者表达有助于食管鳞癌的病情判断及预后评估。