慢性丙肝患者外周血单核细胞中TLR2、CTLA-4 mRNA的表达及意义

朱建光，沈露，周汉义，郑曦，刘启胜

咸宁市中心医院(湖北科技学院附属第一医院)，湖北咸宁437100

慢性丙型肝炎(CHC)是一种因感染丙型肝炎病毒而导致的慢性肝脏疾病，临床主要表现为食欲不振、黄疸症状。CHC患者中约50%处于慢性持续感染状态，后期可并发肝硬化、肝性脑病、肝癌等，对患者的健康造成严重影响[1]。因此，定期复查，全面了解和评估肝功能和肝纤维化程度对延缓疾病进展至关重要，目前临床主要应用肝穿刺活检评估肝纤维化程度，但由于肝穿刺活检为有创操作，易并发出血，临床应用受限[2]。所以，寻找一种无创而高效的方法评价肝纤维化程度成为亟待解决的难题。细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)是表达于T细胞的自分泌因子，可通过调节T细胞分泌免疫相关因子，参与CHC进程。Toll样受体2(TLR2)是丙型肝炎病毒的主要致病通路。目前关于TLR2及CTLA-4与肝纤维化的关系鲜见报道[3，4]。2017年1月—2019年12月，我们检测了CHC患者外周血单核细胞中TLR2及CTLA-4 mRNA的表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2017年1月—2019年12月于我院就诊的CHC患者100例(CHC组)。纳入标准：①符合CHC的诊断标准[5]；②住院时间大于1周；③患者或其家属签署知情同意书。排除标准：①合并肾、心血管、泌尿等其他系统严重疾病者；②同时合并甲肝、乙肝病毒感染者；③近期有感染或血液系统疾病者。男68例、女32例，年龄(63.58±2.58)岁，BMI(23.19±1.28)kg/m2。随机选择同期体检健康者100例作为对照组，男70例、女30例，年龄(64.14±1.46)岁，BMI(23.56±1.65)kg/m2。两组性别、年龄、BMI差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究经我院伦理委员会批准，患者或其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 肝纤维化的诊断和分期 于B超引导下选择右腋前线第7、8、9肋间作为穿刺区域，穿刺时注意避开心脏和大血管，取组织活检，并分别由2名以上病理科专业人员对组织图片进行判读，根据肝纤维化程度分为5期，F4期：早期肝硬化；F3期：大量纤维间隔形成，肝小叶结构紊乱但无肝硬化；F2期：纤维化扩大至汇管区周围并形成纤维间隔，肝小叶结构仍保留；F1期：窦周及小叶内纤维化，局限性汇管区纤维化扩大；F0期：无明显纤维化[6]。本研究F0期15例，F1期19例，F2期39例，F3期21例，F4期6例。

1.3 实验室相关指标检测 CHC组于入院当天(对照组于体检日)抽取空腹外周静脉血10 mL，3 000 r/min离心6 min(离心半径10 cm)，静置取上清，用全自动生化分析仪(山东博科生物产业有限公司，BK-200)和血液分析仪(广州市乐邦医疗器械有限公司，SK5002)检测血清血小板(PLT)、甲胎蛋白(AFP)、AST、ALT、谷氨酰基转移酶(GGT)、TC和总胆红素(TBil)，并根据PLT、ALT、GGT、CHOL、AST值计算基于4因子的纤维化指数(FIB-4指数)、天门冬氨酸氨基转移酶-血小板比值指数(APRI)、Forns 指数[7]。FIB-4 指数=年龄(岁)×AST(U/L)/血小板计数(×109/L)×ALT1/2(U/L)；APRI=AST(U/L)÷PLT(×109/L)；Forns指数=7.811-3.131×ln(PLT[×109/L])+0.781×ln(GGT[IU/L])+3.467×ln年龄-0.014×CHOL[mmol/L]。

1.4 CHC患者外周血单核细胞中TLR2 mRNA及CTLA-4 mRNA表达检测 用Ficoll密度离心法分离外周血单核细胞，提取细胞中的RNA，并用紫外分光光度计(深圳市科力易翔仪器设备有限公司，UV3200S)测量RNA的量，再利用逆转录酶合成cDNA，用RT-PCR(仪器及试剂盒由深圳市康初源有限公司提供，货号：210212)检测TLR2 mRNA(正向引物序列：5′-TTTGCTGGACTTACCTTCCTTG-3′，反向引物序列:5′-CAGTATCTCGCAGTTCCAAACA-3′)及CTLA-4 mRNA(正向引物序列：5′-GACCAGGGACTCTACATCTGC-3′，反向引物序列：5′-TCACATTCTGGCTCTGTTGG-3′)的表达量。RT-PCR扩增循环设置参数：预变性(94 ℃, 1 min)后，进行45个循环扩展梯度(94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min)，末次延伸(72 ℃,10 min)。以空白对照进行基线调整，以β-actin作为内参基因，采用2-△△CT方法计算目的mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 两组实验室指标比较 CHC组AST、AFP、ALT、GGT、TBil、CTLA-4 mRNA、FIB-4 指数、APRI、Forns 指数高于对照组，PLT、TLR2 mRNA低于对照组(P均<0.05)，见表1。

表1 两组实验室指标结果

2.2 不同肝纤维化程度者血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表达比较 随着肝纤维化程度增加，CTLA-4 mRNA表达升高、TLR2 mRNA表达降低，组间差异有统计学意义(P均<0.05)，见表2。

表2 CHC组不同纤维化分级患者血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表达比较

2.3 CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA与肝纤维化的相关性 相关性分析结果显示，AST、AFP、ALT、FIB-4 指数、APRI、Forns 指数与CTLA-4 mRNA表达呈正相关(r分别为0.427、0.547、0.351、0.572、0.472、0.569，P均<0.05)，与TLR2 mRNA表达呈负相关(r分别为-0.471、-0.427、-0.317、-0.488、-0.533、-0.468，P均<0.05)；PLT与CTLA-4 mRNA表达呈负相关(r=-0.427，P<0.05)，与TLR2 mRNA表达呈正相关(r=0.571，P<0.05)，总胆红素与CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表达无关(r分别为0.132、0.174，P均>0.05)。

2.4 发生明显肝纤维化(F2～F4)与无或轻度肝纤维化(F0+F1)患者临床指标比较 无或轻度肝纤维化的AST、PLT、AFP、ALT、FIB-4 指数、APRI、Forns 指数、GGT、CTLA-4 mRNA小于明显肝纤维化，TLR2 mRNA大于明显肝纤维化(P均<0.05)，两者总胆红素比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 明显肝纤维化与无或轻度肝纤维化患者临床指标结果

2.5 血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA水平预测明显肝纤维化的诊断效能 CTLA-4 mRNA诊断明显肝纤维化的临界值为1.35，灵敏度为0.836，特异度为0.894，ROC曲线下面积为0.889(95%CI:0.834～0.944)，TLR2 mRNA诊断明显肝纤维化的临界值为1.10，灵敏度为0.816，特异度为0.885，ROC曲线下面积为0.868(95%CI:0.803～0.933)。见图1、图2。

图1 CTLA-4 mRNA诊断明显肝纤维化的ROC曲线

图2 TLR2 mRNA诊断明显肝纤维化的ROC曲线

3 讨论

CHC是一种慢性肝脏炎性疾病，由急性丙型肝炎病毒感染转化而来，易进展为肝硬化、肝癌，其中肝纤维化在CHC疾病进展中发挥重要作用[8]。肝纤维化是肝脏疾病进展为肝硬化的阶段之一，早期肝纤维化为一种可逆过程。因此，早期对肝纤维化程度进行评判对控制甚至逆转患者病情有重要作用。肝穿刺活检为判断肝纤维化的金标准，但由于存在风险和费用高昂等原因难以在临床上推广，而目前临床上使用的无创性检查包括影像学检查和APRI等的准确性有待提高[9]。基因与肝纤维化的相关研究成为研究热点。研究表明，相关基因可通过表达一系列细胞因子，参与CHC疾病的发生发展[10]。

研究表明，丙型肝炎所致肝硬化是由于丙型肝炎病毒感染后，机体免疫紊乱而导致的疾病，丙型肝炎病毒可通过刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，破坏CD3、CD4细胞，使相关细胞不能发挥免疫杀伤和免疫调节作用，从而不能有效发挥清除病毒，使病情迁延不愈[11，12]。CTLA-4、TLR2被认为是免疫相关细胞表面蛋白，主要由调节性T淋巴细胞合成。CTLA-4是免疫球蛋白超基因家族成员，与B7具有较高的亲和力(CD28的10倍)，对T细胞增殖及免疫反应均有负向调节作用。正常情况下，外来免疫原激活机体免疫时促使CD28与B7结合，促进T细胞的增殖活化，发挥免疫作用清除异物。而CHC患者体内CTLA-4表达显著升高，CTLA-4竞争性与CD229同B7结合，形成免疫抑制复合物，阻碍CD28信号通路传导，下调T细胞的活性，减缓T细胞的活化与增殖，从而使机体对丙肝抗原的清除作用减弱，使病情加重[3]。TLR2是一种重要的膜蛋白识别受体，具有抗原识别作用，当丙型肝炎病毒侵入机体时被激活，使NF-κB等通路活化，进一步激活下游的炎性因子和细胞因子，参与对病毒的清除作用[11]。本研究结果显示，CHC患者体内CTLA-4 mRNA表达升高，而TLR2 mRNA表达降低。进一步对肝纤维化亚组分析，随着肝纤维化程度的加重，CTLA-4 mRNA逐渐增加，TLR2 mRNA逐渐减小。表明CHC患者肝纤维化受累程度越重，体内CTLA-4蛋白表达增加而TLR2蛋白减少，免疫抑制程度加深。胡安印等[12]研究发现，CTLA-4是多种免疫性疾病的介导因子，在类风湿、自身免疫性肝病等多种疾病中发挥作用。杨景毅等[13]研究发现，TLR2可通过MAPK/ERK通路抑制乙肝病毒的复制，促进机体对病毒的清除作用，延缓慢性乙肝以及肝硬化的进程，临床不仅可通过检测TLR2水平评估肝硬化的程度，也为肝癌的治疗提供了突破口。

进一步研究发现，CHC组AST、AFP、ALT、GGT、总胆红素、CTLA-4 mRNA、FIB-4 指数、APRI、Forns 指数高于对照组，PLT、TLR2 mRNA低于对照组。CHC患者肝细胞严重破坏，对胆红素的处理能力降低，肝细胞内的酶如AST、ALT、GGT释放入血，可通过检测血液中肝细胞内酶的含量来评价肝功能，同时肝脏是造血器官，慢性肝炎时PLT的含量明显降低。FIB-4指数、APRI、Forns 指数是通过计算患者年龄、AST、ALT、GGT等得到的，是目前临床上较常使用的肝纤维化评价指标。沈伟等[14]研究发现，APRI对肝纤维化的特异度较高，肝纤维化与FIB-4指数、APRI、Forns 指数等呈正相关。本研究结果显示，CTLA-4 mRNA表达与FIB-4 指数、APRI、Forns 指数呈正相关，TLR2 mRNA表达与FIB-4 指数、APRI、Forns 指数呈负相关，证实可通过检测CTLA-4、TLR2 mRNA 表达来判断肝纤维化程度。通过分析发现，CTLA-4、TLR2 mRNA诊断明显肝纤维化的敏感度和特异度均大于0.7，ROC曲线下面积分别为0.889、0.868。提示应用CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA预测肝纤维化有一定临床价值。

综上所述，外周血单核细胞中CTLA-4、TLR2 mRNA表达与CHC患者肝纤维化程度有关。临床可通过检测CTLA-4、TLR2 mRNA来预测肝纤维化情况，并指导临床治疗。