枸杞多糖在AP小鼠体内抗炎、抗氧化应激的作用机制

唐开锋 王剑虹 余家奇

(遵义市第一人民医院 1药剂科，贵州 遵义 563000；2质量管理办公室)

急性胰腺炎(AP)为临床上常见的急腹症之一，且为消化科住院患者的主要病因〔1〕。AP患者的病死率为5%～10%，若AP患者得不到及时干预会很快发展为急性重症胰腺炎(SAP)，出现多脏器损伤和功能衰竭，死亡率高达30%〔2〕。随着对AP疗效研究的不断深入，目前在西药的常规治疗基础上联合中药治疗可提高治疗效果，减少并发症。

枸杞多糖(LBP)是一种从植物枸杞子中提取的水溶性多糖，为枸杞中的主要活性成分〔3〕，为多糖和蛋白聚糖的混合物〔4〕，具有抗肿瘤、抗衰老、抗应激、保肝、保护神经、降血脂、双向调节血糖、增强免疫的功效，更显著的为抗炎、抗氧化作用，其能有效抑制与慢性炎症相关的损伤〔5〕。LBP在糖尿病〔6，7〕、结肠癌〔8〕、神经胶质损伤〔9，10〕、视网膜损伤〔11〕、卵巢上皮血管损伤〔12〕、肾癌〔13〕、肝癌及肝损伤〔14～16〕和膀胱癌〔17〕中均具有保护作用。但LBP在AP中的功能尚未完全清楚。

炎性介质的释放失控造成机体免疫调节网络的紊乱，机体抗炎因子与促炎因子的分泌失衡，有可能会导致全身性炎症反应综合征〔18〕。其中与AP相关的保护性炎症介质有白细胞介素(IL)-10、IL-2、可溶性肿瘤坏死因子受体(STNFR)、IL-1ra、前列环素(PGI)2和一氧化氮(NO)等。NF-κB 信号通路能调节生长因子、转录因子、细胞素、趋化因子等内在基因的转录，参与炎症、细胞凋亡、免疫反应等病理过程，其与炎症性疾病关系密切〔19〕。AP发病早期炎症反应的主要病因是胰腺腺泡细胞内酶源被异常激活，大量的细胞因子IL-6、IL-2、IL-β和TNF-α也被激活，其在AP发生发展中具有重要作用〔20，21〕。氧化应激是机体氧化和抗氧化作用失衡，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激为急性胰腺炎发病机制中的中药调节器〔22，23〕。氧自由基(OFR)和促炎因子的作用在AP发病机制中均具有重要作用〔24〕。大量研究证实，LBP具有抗炎、抗氧化应激作用及炎症和氧化应激在AP中的重要作用〔9，13，21，25〕。但LBP在AP中对炎症和氧化应激的作用机制尚未研究。本研究拟用LBP治疗AP模型小鼠，分析血清中炎性因子的含量和胰腺组织中氧自由基相关指标的变化及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性昆明鼠54只，18～20 g，购自上海凯学生物科技有限公司。

1.2主要药物、试剂和仪器 LBP购自西安森冉生物工程有限公司；雨蛙素、脂多糖(LPS)购自北京宝奥莱博公司；髓过氧化物酶(MPO)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成研究所；雨蛙素购自Sigma公司；炎性因子IL-6、IL-β、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒购自康为世纪；MDA竞争酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自加拿大ELIXIR公司；MPO夹心ELISA试剂盒、SOD ELISA检测试剂盒购自美国Bioxytech；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)试剂盒、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒均购自大连Takara公司；半干转膜仪购自美国BIO-RAD公司；ABI 7500型实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司；紫外分光光度计购自美国Thermo公司。

1.3AP模型的建立 将54只小鼠随机分成3组，每组18只，分别为对照组(灭菌生理盐水)，AP组(雨蛙素联合脂多糖)和LBP组(雨蛙素联合LPS+LBP)。造模前12 h小鼠禁水不禁食。雨蛙素为1 mg/ml，每次间隔1 h，连续给药6次，最后一次另给药后再给药10 mg/ml LPS，即完成造模。治疗组在造模结束0 h和4 h腹腔注射5 mg/ml LBP。

1.4胰腺系数 将对照组、AP组和LBP组小鼠称重，眼球采血，断颈法处死，摘取完整的胰腺组织并称重。胰腺系数=胰腺湿重(mg)/小鼠体重(g)。

1.5胰腺组织病理评分 运用Rongione病例评分标准对对照组、AP组和LBP组小鼠胰腺组织的病理变化进行评分。光镜下观察3组胰腺：胰腺的体积、边界；腺小叶的结构形态、中性粒细胞和红细胞的浸润、水肿；腺泡的轮廓，结构的完整度，胞核胞仁的着色；是否有出血坏死病变等进行综合评价。

1.6ELISA 用ELISA试剂盒测定小鼠血清中IL-6、IL-β、TNF-α的含量。采用竞争性抑制ELISA试剂盒检测MDA；夹心ELISA试剂盒检测MPO；ELISA试剂盒检测SOD。

1.7qRT-PCR 用无菌生理盐水研磨胰腺组织，用RNA抽提试剂盒提取总RNA，微量分光光度计进行RNA定量后，用逆转录试剂盒合成cDNA。最后按照qRT-PCR试剂盒说明书操作，检测样品中p65 mRNA的表达，用2-△△Ct计算p65的相对表达水平，每个样品重复检测3次。

1.8Western印迹 用无菌生理盐水研磨胰腺组织，低温离心后提取细胞核蛋白，BCA法进行定量。按照Western印迹实验常规操作流程进行电泳-转膜-封闭-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-显影曝光。Image J分析目的条带灰度值，以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示p65蛋白的表达。

1.9统计学处理 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组胰腺系数比较 AP组胰腺系数(11.49±0.83)显著高于对照组(5.83±0.16)，LBP组(8.12±0.47)显著低于AP组，3组比较差异有统计学意义(F=77.993，P=0.000)。

2.2各组胰腺组织损伤情况比较 AP组胰腺组织病例评分〔(6.53±0.73)分〕显著高于对照组〔(0.22±0.04)分〕，LBP组〔(5.16±0.45)分〕显著低于AP组，3组比较差异有统计学意义(F=134.525,P=0.000)。

2.3各组炎性因子表达比较 AP组IL-6、IL-β、TNF-α水平显著高于对照组，LBP组显著低于AP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组IL-6、IL-β、TNF-α水平比较

2.4LBP对小鼠体内氧化应激的影响 AP组MDA、MPO水平显著高于对照组，LBP组显著低于AP组(P<0.05)；AP组SOD水平显著低于对照组，LBP组显著高于AP组(P<0.05)。见表2。

表2 各组MDA、SOD、MPO水平比较

2.5LBP对NF-κB信号通路的影响 AP组p65 mRNA、p65蛋白表达(1.83±0.15，0.76±0.06)显著高于对照组(1.01±0.08，0.38±0.04；P<0.05)，LBP组(1.19±0.10，0.57±0.05)显著低于AP组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 LBP对NF-κB信号通路的影响

3 讨 论

现代医学认为AP是暴饮暴食、酗酒、高钙血症、高脂血症、感染和某些药物引起的胆汁胰液逆流，激活胰酶使胰管压力增高，部分胰管破裂，进而胰液渗入胰间质导致胰腺的自我消化，其在AP的治疗上以抑制胰腺的分泌功能为主。传统医学认为AP的发生多由六淫之邪、饮食不节、情志失畅、创伤等引起肝郁气滞、肝胆湿热、胃肠热结，其在治疗上以通导为主〔25〕。目前，临床上多采用中西医结合的方法治疗胰腺炎。

枸杞子为我国传统的名贵中药材。《本草纲目》记载“枸杞，补肾生精，养肝，明目，坚精骨，去疲劳，易颜色，变白，明目安神，令人长寿”，故有“红宝”之称〔26〕。枸杞子富含LBP、甜菜碱、氨基酸、胡萝卜素、维生素B、维生素C、钙、磷、铁等多种营养成分，具有很高的营养价值。LBP为枸杞子的主要活性成分，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖6种单糖组成，含有多种微量元素和氨基酸的蛋白杂多糖〔27〕。王建东等〔28〕以滩羊为研究对象，用LBP饲喂滩羊发现，LBP可提高滩羊抗体水平和细胞因子的分泌；王晓丽等〔29〕在子宫内膜上皮细胞的研究中发现，LBP能抑制过氧化氢诱导的子宫内膜上皮细胞的损伤，对子宫内膜上皮细胞具有保护作用。大量研究显示，LBP对多种疾病损伤和肿瘤均具有保护作用〔26～29〕。本研究结果显示，LBP对雨蛙素联合LPS诱导小鼠胰腺损伤具有保护作用。

NF-κB为一种可以调控炎症反应的重要转录因子。NF-κB被活化后进入细胞核内，对炎性因子TNFα、IL-1β、IL-6和iNOS等炎症基因进行表达〔30〕。Jin等〔31〕研究报道，LBP可抑制NF-κB通路，下调促炎介质和趋化因子，缓解肝脏炎症，阻断NF-κB通路可抑制炎症反应；LBP可通过抑制血清中炎性介质IL-6、IL-1、TNF-α表达，减轻脑缺血导致的脑病理组织损伤及神经功能障碍〔32〕；有研究报道，AP患者血浆中LPO、MPO含量升高，SOD活性降低〔33〕；韩丽娜等〔34〕研究揭示LBP保护AP小鼠胰腺损伤的作用机制。

综上，LBP可保护AP小鼠胰腺损伤，其机制可能与抗炎、抗氧化应激有关，将为LBP用于胰腺炎的临床治疗提供实验依据。