不同晶面能纳米硫化镉致小鼠血液学指标改变及肝组织损伤的研究

郝卓璐 任艺艺 王立元 许明颜 李清钊 曹燕花 孟春燕

华北理工大学公共卫生学院 河北唐山 063210；①河北省秦皇岛市青龙满族自治县医院

近年来，纳米材料已被广泛用于科研和生产的各个领域，使人类暴露于纳米颗粒的途径变得多种多样[1]。纳米材料的化学特性、毒性主要决定于其粒径和长度[2-3]，但对于粒径相同但晶面能不同的纳米材料的毒性大小以及致毒作用机制的研究较少。纳米硫化镉(nano-CdS)是目前使用较为广泛的半导体材料，因其良好的性能而具有广泛的潜在应用价值[4]。本文主要研究粒径相同但晶面能不同的两种纳米硫化镉材料对小鼠血液指标及肝脏组织的毒性作用，探讨晶面能的差异性是否影响纳米材料的致毒作用。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂 全自动生化测定仪(型号：AU5800，美国，贝克曼库尔特)；血常规检测仪(型号：BC-2600，中国，迈瑞公司)；MDA试剂盒和NO检测试剂盒均购自南京建成生物制品公司。

1.2实验动物 24只清洁级昆明种小鼠，体重18～22g，饲养于华北理工大学实验动物中心，动物证号SCXK(京)2009-0004，饲养环境温度(22±2)℃，湿度(50±10)%，12小时昼夜交替光照。以灭菌常规鼠粮和蒸馏水供小鼠自由取食、饮水。

1.3纳米材料 纳米硫化镉表征：本研究所用的两种纳米硫化镉材料为单晶结构的纳米棒，直径20～30nm，长度80～100nm，CdS1和CdS2分别为沿不同晶面生长的两种纳米材料，见图1。经拟合计算CdS2的晶面能量高于CdS1(纳米材料及晶面能计算数据由南开大学环境科学与工程学院刘璐教授惠赠)。

图1 两种纳米硫化镉的电镜照片(a: CdS1[5]；b: CdS2 )

1.4染毒方式 动物随机分为对照组、CdS1组和CdS2组，每组8只。以20mg/kg的染毒剂量将两种纳米材料(CdS1和CdS2)用生理盐水配置成0.2mL混悬液，临用时超声混匀。经腹腔注射进行染毒，每周1次连续染毒4周。对照组每次腹腔注射0.2mL的生理盐水。

1.5血常规与血液生化 染毒结束后，采集小鼠眼球血。采集的血样分两部分收集：一部分置于抗凝采血管中检测血液中红细胞数、白细胞数、血小板数、血红蛋白含量、红细胞压积以及红细胞平均体积等指标。另一部分血样置于不含抗凝剂的离心管中，于冰上静置约30分钟，2500r/min(离心半径5cm)离心10 分钟，取上清置另一干净离心管中。检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的含量，并计算相应的比值。血液学检测结果均重复测量3次后取其平均值。

1.6肝脏组织病理检测 采血结束后小鼠脱颈处死。于冰上取小鼠肝脏组织，生理盐水冲洗多余血液，置10%甲醛溶液中进行固定。固定后的肝脏组织经脱水、浸蜡、包埋、切片等步骤制作成石蜡切片，进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织病理学改变。

1.7氧化损伤检测 每只小鼠取100mg肝脏组织，用生理盐水对肝脏组织进行超声匀浆，离心后取上清液待测。取小鼠血清及肝脏组织蛋白提取液，按照试剂盒说明书的方法分别检测血清和组织液中丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的含量。

1.8统计学方法 用Excel软件录入数据，并用SPSS 13.0统计软件处理数据，采用One-way ANOVA分析各组别之间的差异，进一步采用SNK法进行两两比较，检验水准α=0.05，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同晶面能nano-CdS对小鼠血常规的影响 CdS1、CdS2组与对照组相比白细胞数、血小板数量显著增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)；且CdS2组血小板数量显著高于CdS1组，差异有统计学意义(P<0.05)。CdS2组与对照组相比血红蛋白含量、红细胞压积、红细胞平均体积均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；红细胞数有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两种晶面能nano-CdS对小鼠血常规指标的影响

2.2两种晶面能nano-CdS对小鼠血液生化指标的影响 染毒结束后小鼠血清生化指标的变化见图2。与对照组相比，CdS1组与CdS2组血清中AST/ALT比值显著增高，且CdS2组较CdS1组显著增高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图2 小鼠血液生化指标的变化注：与对照组相比，*P<0.05 ；与CdS1组相比，#P<0.05

2.3两种晶面能nano-CdS对小鼠肝脏的损伤情况 对照组肝脏组织结构清晰完整，肝索排列整齐呈放射状，可见正常肝血窦、中央静脉以及门管区。正常肝细胞为多边形，细胞核为圆形，见图3A。CdS1组小鼠肝脏组织切片中肝细胞结构尚完整，细胞轻微水肿，胞浆内有散在粉染匀细颗粒,见图3B(如↓所示)。CdS2组肝脏组织切片中可见肝细胞结构模糊且排列紊乱，胞浆出现轻度水肿，肝脏组织内出现明显的炎性细胞浸润，见图3C(如→所示)。

图3 两种nano-CdS对小鼠肝脏组织病理的影响(10×40)

2.4两种晶面能nano-CdS对小鼠肝脏组织以及血清中氧化应激产物的影响 CdS1组血清中MDA含量与对照组相比无明显变化，而CdS2组显著高于对照组、CdS1组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图4A。与对照组相比， CdS1组和CdS2组血清中NO含量均显著升高，且CdS2组高于CdS1组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图4B。CdS1与CdS2组肝脏组织中MDA含量以及NO含量变化不明显。

图4 两种nano-CdS对小鼠血清和肝组织氧化损伤的比较注：与对照组相比，*P<0.05 ；与CdS1组相比，#P<0.05

3 讨论

随着纳米材料在人们生产生活中广泛应用，其对机体的损伤作用也受到更多关注。纳米材料具有量子尺寸效应的同时拥有比表面大的表面效应，能够直接穿透细胞膜进入到细胞内，与生物大分子结合发生反应，在体内可以进行缓释、靶器官蓄积、免疫识别等功能，因此纳米材料的毒性比常规材料更大；纳米材料的毒性与粒径、浓度、形态等相关[2-4]，此外，晶面能也是影响其毒性的一个因素。晶面能可以通过改变晶体的形态而改变表面积，进而对纳米粒子的毒性产生不同影响。研究发现纳米材料晶面能越高，材料本身的稳定性就越差，因而其反应活性也就越高[6-7]。

白细胞在机体防御系统中发挥着关键作用，具有抗炎、预防感染、伤口修复等功能；红细胞数量体现血液运输氧气和二氧化碳的能力；血小板具有促凝、止血、抑制纤溶系统的生理功能，因此血液学指标在一定程度上能够反映机体的生理状态[8-9]。本实验结果表明，nano-CdS对小鼠进行染毒后，小鼠血细胞计数变化显著，白细胞数量明显增多，提示小鼠体内存在炎症反应；红细胞数量下降，血红蛋白、红细胞压积、红细胞平均体积等血液学指标水平均降低，提示血液正常携氧功能受到抑制；血小板数量显著增加，提示凝血功能异常。这可能是由于炎症细胞因子增多，促进血小板聚集，也可能与红细胞在生成过程中被纳米粒子破坏有关[9]。以上结果中，具有较高晶面能的CdS2损伤作用均较CdS1变化明显。

AST和ALT含量可体现肝脏代谢及通透性变化，其比值能较敏感地反映肝脏功能[10]。本研究结果中，nano-CdS引起血清中AST/ALT升高，且CdS2组较CdS1组高(图2)。组织病理学结果显示，晶面能不同的两种nano-CdS均能造成小鼠肝脏组织病理学改变(图3)，CdS2组肝脏组织内明显可见炎症细胞浸润。以上结果均提示nano-CdS可造成小鼠血液学指标的改变，引起肝脏功能改变，造成肝脏组织损伤，且纳米材料晶面能越大，其损伤作用越明显。

MDA是脂质过氧化反应的标志性产物[11]。诸多研究结果均证实纳米材料进入机体后会诱导氧化应激，导致自由基和活性氧的产生，诱导机体发生氧化损伤[12-13]。纳米材料进入机体内可诱导机体活性氧(ROS)、活性氮(RNS)水平上升。多余的ROS可与脂质、DNA、蛋白质等多种生物大分子发生氧化反应，从而引起血清中脂质过氧化产物MDA水平等明显增加[13]。NO作为氧化应激反应中一类重要的信号传导分子[14]，可能诱导RNS生成增加，破坏氧化还原系统的平衡。大量NO可刺激下游信号通路，增强血管通透性，使其释放更多的炎症因子，从而加重机体的炎症反应[15-16]。本研究结果显示染毒组小鼠血清氧化应激产物增多，且晶面能较高的CdS2生成的氧化产物更多(图4)。CdS2具有较高的晶面能和较强的反应活性，因此机体的氧化应激反应表现的更为剧烈。氧化应激反应可刺激免疫系统，破坏血管内皮细胞，释放更多的炎症介质，造成血液学指标变化[17]。本研究中肝脏病理学已经发生改变，但在肝脏组织中MDA、NO水平的变化并无统计学差异。分析原因可能与肝脏代谢水平高有关，组织中的氧化产物被快速转移至血清中[18]，也可能因为检测敏感度不够。关于这两种不同晶面能nano-CdS材料对肝脏组织的毒作用机制有待深一步研究和探讨。

以上实验结果均提示nano-CdS可以造成机体血液系统和肝脏组织损伤，晶面能高的纳米材料可能具有更高的反应活性，稳定性相对较差，在肝脏损伤、炎症等方面毒作用更强。国际上已经开始重视纳米材料毒性的防护工作，唐敬龙等也对2017年WHO发表的《人造纳米材料职业防护指南》做了解读，指导职业暴露人群如何采取有效保护措施[19]，本文研究结果从晶面能角度评价纳米材料的毒性，也可指导纳米材料的职业防护。