超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中4种减肥类非法添加药物

朱 吕 陆春燕 厉晨皓 贺慧琳 刘 俊

(平湖市食品药品检测中心， 平湖 314200)

双醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脱乙酰比沙可啶均为临床上经常使用的缓泻剂。双醋酚汀在肠道内遇碱性肠液，被分解为酚汀及醋酸，酚汀能肠壁引起蛹动，而发挥导泻作用。比沙可啶是一种于1952年就在国外上市的缓泻剂，2010年比沙可啶及其片剂已被《中国药典》收载[1]，它主要通过直接接触肠黏膜并刺激其感觉神经末梢而增强肠反射性蠕动，促进排便。近年来部分临床医生发现长期大量口服比沙可啶副作用较大，尤其是对结肠的刺激或损伤作用，在人结肠测压中发现比沙可啶可引发高振幅推进性收缩，导致部分临床工作者对比沙可啶的临床应用存在一定的质疑[2，3]。酚酞也是一种致泻药，能直接刺激肠黏膜或活化肠内平滑肌的神经末梢而增加肠的推进力，因产生过度缓泻而导致体液与电解质障碍，使血糖升高，血钾降低，造成电解质紊乱，诱发心律失常、神志不清、肌痉挛以及倦怠无力等症状，另外，长期使用可损害肠神经系统，且很可能是不可逆的[4，5]。双醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脱乙酰比沙可啶4种化学药物的结构式如图1～4。

图1 双醋酚汀结构式

图2 比沙可啶结构式

图3 酚酞结构式

图4 脱乙酰比沙可啶结构式

近年来，一些所谓的健康无添加的减肥产品以日常食品为载体，大肆宣称具有较好的减肥功效，受到爱美人士的追捧。然而，这其实是一些不良商家在食品中非法添加了致泻类化学药物，通过致泻达到减肥目的。有文献报道，有成千上万的人是轻泻剂成瘾者。用药者往往频繁和持续使用，一旦停用，便秘便会变本加厉严重者甚至造成人体器官衰竭[6，7]。不良商家为了逃避打击，已很少在食品中添加国家明令禁用的化学药物(如西布曲明、芬氟拉明等)，转而在食品中非法添加双醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脱乙酰比沙可啶等缓泻剂。除酚酞在食品中的检测有相关国家标准外[8]，其他3种缓泻剂均无相应的食品检测方法和检测标准，相关的文献报道主要是药物片剂分析、人体药物代谢、药物动力学性质等[ 9-11]。

目前用于减肥类食品中非法添加药物的检测方法主要有液相色谱法[12，13]、液相色谱-串联质谱法[14-16]、拉曼光谱法[17]等。 其中，液相色谱-串联质谱法因具有高选择性、高灵敏度的优点在食品中非法添加药物的定性及定量分析中获得了广泛的运用。本实验通过优化提取过程、净化过程和检测参数建立了一种简便可靠、可操作性强、准确度高的检测方法，可用于同时测定食品中双醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脱乙酰比沙可啶的非法添加。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脱乙酰比沙可啶标准品(纯度≥98.0 %)：德国Dr.Ehrenstorfer；甲醇、乙腈(色谱纯)：美国Thermo Fisher公司；氯化钠(分析纯)：国药集团；HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg)、PSA固相萃取柱(3 mL/60 mg)：美国Waters公司；C18固相萃取柱(3 mL/60 mg)：深圳逗点生物技术有限公司；Alumina-N固相萃取柱(3 mL/200 mg)：上海安谱科学仪器有限公司；有机微孔滤膜(0.22 μm)：天津Agela Technologies公司；超纯水：实验室自制。

Waters Xevo TQ-S高效液相色谱串联质谱仪：美国，Waters公司；T25高速均质机：德国，IKA公司；MS204S、PL602-L 电子天平：瑞士，梅特勒-托利多公司；H2050R-1高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Milli-Q Advatantage A10超纯水机：法国，Merck Millipore公司；KQ3200超声波清洗器：昆山市超声波仪器有限公司；K600多功能食品粉碎机：德国， BRAUN公司。

1.2 标准溶液配制

准确称取双醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脱乙酰比沙可啶4种化学药物标准物质各5.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成浓度为500 μg/mL的标准溶液储备液，4 ℃避光储存。分别吸取0.5 mL双醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脱乙酰比沙可啶标准储备液至50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成5.0 μg/mL的混合标准中间液。临用时用流动相逐级稀释至1.0、5.0、20.0、50.0、200.0、350.0、500.0 ng/mL的混合标准物质工作液。

1.3色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC®BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)，流动相A：乙腈；流动相B：20mmol/L甲酸铵溶液；流速：0.5mL/min；进样量：1 μL；柱温：40℃。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

1.4 质谱条件

电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)；多反应监测(multiple reaction monitoring , MRM)；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：450 ℃；脱溶剂氮气流速：950 L/h；毛细管电压：3 kV。在电喷雾正离子模式下分别对500 ng/mL的单个标准溶液进行全扫描，通过优化离子源、离子管温度和辅助气流量等参数是母离子响应达到最优值，并优化得到每个化学药物的母离子和子离子所需的最佳去簇电压和碰撞能量，最后以多反应监测模式进行扫描，选择离子信号前两强分别作为定性和定量离子。具体质谱参数见表2。

表2 4种化学药物的质谱检测参数

1.5 样品前处理

称取粉碎均匀的固体样品0.5 g(液体样品1.0 g)于15 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混匀样品，超声提取10 min。加入1.5 g干燥后的氯化钠，涡旋2 min，8000 r/min离心5 min。准确移取乙腈层5 mL，氮气吹至约0.5 mL后加入5 mL水涡旋混匀，待固相萃取净化。

将C18固相萃取小柱安装至固相萃取装置上，依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱，将待净化的样品回溶液加入小柱，流尽后用5 %甲醇水溶液淋洗小柱，吹干，最后用5 mL 80%甲醇水洗脱，收集全部洗脱液于5 mL容量瓶中，甲醇水定容至刻度线，定溶液用0.22 μm有机微孔滤膜后上质谱测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本研究分别采用了甲醇水溶液、乙腈水溶液、0.1%甲酸水-甲醇溶液、0.1%甲酸水-乙腈溶液和20 mmol/L甲酸铵水-乙腈溶液5种流动相体系进行色谱分析。通过对分离效果的综合评价，采用20 mmol/L甲酸铵水-乙腈作为流动相时，各组分化学药物的离子化效率高，分离度、峰型好，响应值高，各组分化学药物标准溶液(50 ng/mL)的多反应监测色谱图见图5。

图5 双醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脱乙酰比沙可啶质谱图

2.2 提取方法的优化

本研究对比分别使用甲醇、乙腈作为提取溶剂时的提取效率。结果发现，两种溶剂对目标化学药物的提取效率无明显差异，但是在处理液体样品时加入盐离心后，乙腈能够有效的分离水相和有机相，故最终选择乙腈作为提取溶剂。

本研究考察了氮吹回溶待净化液中不同乙腈浓度对4种目标化学药物回收率的影响。结果如图6所示，待净化液中乙腈含量在不超过10 %时，对待测各组分回收率无明显影响，故样品前处理时采取移取乙腈层5 mL，氮吹至约0.5 mL后加入5 mL水涡旋混匀成待净化液。

2.3 净化方法的优化

本实验研究了Alumina-N固相萃取柱、PSA固相萃取柱、HLB固相萃取柱和C18固相萃取柱对双醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脱乙酰比沙可啶回收率的影响。如表3所示， 采用Alumina-N和PSA固相萃取柱时，双醋酚汀和比沙可啶回收率大于60 %，酚酞、脱乙酰比沙可啶均小于40 %；采用C18和HLB固相萃取柱时，4种化学药物的均回收率大于70%，相比较C18固相萃取柱稳定性和精密度比HLB固相萃取柱好，故选择C18固相萃取柱作为本实验的净化柱。

图6 净化液中乙腈浓度对4种化学药物(50 ng/mL)回收率的影响

表3 4种固相萃取柱的净化回收率(n=3)

本实验考察了以C18固相萃取柱作为净化小柱时不同浓度甲醇水溶液作为洗脱液时的洗脱效果。将4种目标化学药物的水溶液上样，然后分别用浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的甲醇水溶液洗脱，洗脱液质谱测定，分析不同浓度甲醇水溶液条件下各目标化学药物的洗脱效果(见图7)。结果表明，当以80%甲醇水溶液为洗脱溶剂时，目标化学药物均能够完全被洗脱。因此选择80%甲醇水溶液作为固相萃取时的洗脱溶液。

2.4 标准曲线与检出限

在1.3和1.4中确定的色谱条件和质谱条件下，取混合标准工作液用流动相配制1.0、5.0、20.0、50.0、200.0、350.0、500.0 ng/mL系列浓度的标准溶液进行检测，以各组分的质量溶度(x)为横坐标，定量离子的峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，得到各组分的线性回归方程和相关系数(r2)。如表4所示，4种化学药物的线性相关系数均大于0.99，表明各组分在1.0 ～ 500.0 ng/mL浓度范围内均具有良好线性关系。在空白的样品中添加适量浓度的混合标准溶液，按照1.5方法进行样品前处理后质谱检测，以3倍信噪比(S/N)计算方法检出限(limits of quantification, LOD)，结果见表4。

图7 洗脱液中甲醇浓度对4种化学药物(50 ng/mL)回收率的影响

表4 4种化学药物的曲线方程、相关系数和检出限

2.5 添加回收率与精密度

称取空白固体样品0.5 g(液体样品1.0 g)若干份，分别添加10.0、100.0、1000.0 μg/kg 3个不同水平的混合标准溶液， 按照1.5的样品前处理的方法进行前处理，在优化好的色谱、质谱条件下进行测定。每个添加水平平行测定6次，统计数据，计算方法的回收率和精密度。如表5所示，各组分化学药物的加标回收率在79.2%～111.8%之间，精密度(RSD)为0.21%～13.3%，表明本研究建立的测定方法具有良好的准确度和精密度，可以满足检测实验室日常检测分析需求。

表5 4种化学药物的平均回收率和精密度(n=6)

2.6 实际样品检测

采用本实验建立的方法对市售宣称具有减肥功效的食品及保健食品进行检测，其中包括固体饮料、酵素类饮料、代餐粉、果脯类、蜜饯类等共计25批次。结果显示，在25批次样品中1批次检出酚酞成分，2批次检出双醋酚汀和脱乙酰比沙可啶。

3 结论

建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中双醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脱乙酰比沙可啶4种非法添加化学药物的分析检测方法。该方法前处理操作简便，对不同食品基质净化效果好，灵敏度、准确度和精密度高，回收率稳定，可用于食品中非法添加化学药物的检测工作提供有力技术支持，为打击食品中非法添加减肥类化学药物行为提供有力依据，保证消费者的合法利益。