寻常型天疱疮患者血清对HaCaT细胞Dsg、MMP-9表达的影响

谢志敏， 潘乔林, 张怡， 沈旭成， 邓慧妍,, 戴向农,， 叶兴东,

(1.广州医科大学皮肤病研究所；2.广州市皮肤病防治所，广东 广州 510095)

天疱疮(pemphigus)是一种慢性自身免疫性大疱性皮肤病，典型表现为红斑基础上松弛性水疱、Nikolsky征阳性、难愈的糜烂伴表面污秽性褐色结痂，病理特征为表皮内水疱且可见棘层松解细胞[1]。依据临床和病理表现，天疱疮分为寻常型、红斑型、落叶型以及增殖型天疱疮四种类型，其发病机制主要是患者存在针对角质形成细胞(keratinocyte, KC)桥粒芯糖蛋白(desmoglein，Dsg)的自身抗体IgG结合到KC诱发炎症，导致桥粒破坏和棘层分解，但详细机制仍然未明。李惠等[2]报道了寻常型和副肿瘤型天疱疮患者血清使HaCaT细胞Dsg3 mRNA转录较对照组转录水平上升1.5～1.8倍。早期研究显示，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)9可能参与了PV棘层松解过程[3]，但详细机制未明。本研究探讨PV血清对Dsg1、Dsg3、MMP-9的mRNA转录及蛋白表达的影响，进一步阐明天疱疮棘层松解的机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象

共收集7例PV患者治疗前的血清，其中男3例，女4例，年龄32～72岁，平均(36.4±3.9)岁，所有患者均通过临床和病理诊断为PV并符合如下标准：①皮肤粘膜红斑基础上松弛性水疱或大疱；②皮损污秽样结痂且糜烂潮湿难以愈合；③皮损或其边缘正常皮肤Nikolsky征阳性；④皮肤病理检查表皮内水疱，荧光检查棘层网状亮绿色荧光IgG沉积。纳入标准[4-5]：①符合以上PV诊断标准；②最近30天内未使用过免疫抑制剂和糖皮质激素；③无其他自身免疫性疾病；④非妊娠期及哺乳期；⑤无重要脏器功能不全。排除标准：①不能除外药物性天疱疮者；②合并恶性肿瘤者；③口服过四环素类、大环内酯类抗菌素者；④不同意参加本研究者。同期收集7例健康体检志愿者血清作为对照，其中男3例，女4例；年龄30～69岁，平均(38.5±3.6)岁，与PV患者性别(P>0.05)、年龄(t=1.05，P=0.16)相比无明显差异。本研究及所有相关实验均经本所伦理委员会审核批准(批件号：201802)。受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

HaCaT细胞由广州烨善生物科技有限公司提供。实验试剂：胎牛血清(Hyclone，美国)，DMEM-高糖培养基(Hyclone)，青链霉素(Hyclone)，PBS缓冲液(Hyclone);鼠抗人Dsg1抗体、鼠抗人Dsg3抗体、兔抗人MMP-9抗体、兔抗人GAPDH均购自英国Abcam公司，HRP山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP山羊抗小鼠IgG均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；细胞核染液DAPI购自广州凯基生物技术公司;AK23(一种致病性的抗Dsg3单抗，从天疱疮小鼠模型中获取)由日本MBL公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 HaCaT细胞培养 用干燥管采集患者治疗前及对照者静脉血10 mL，分离血清。为了减少不同PV患者血清成份的差异对细胞实验的影响，参照既往文献报道[6]，将7例患者血清混匀用于本研究。HaCaT细胞培养至80%融合时传代，6孔细胞培养板培养第三代HaCaT融合至50%～60%时，更换含5%患者血清(简称PV血清)的DMEM培养基，以正常培养组(10%胎牛血清)、健康血清组(5%健康血清)为对照，以抗Dsg3单抗作为阳性对照组。放入37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养18 h后收集细胞进行RNA及蛋白分析。因目前尚无商品化的抗Dsg1抗体，本实验以抗Dsg3抗体(AK23)作为阳性对照。

1.3.2 实时定量PCR检测HaCaT细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9基因mRNA表达 用PRIMER5软件/NCBI在线设计Dsg1基因(NM_ 001942)、Dsg3基因(NM_001944)、MMP-9基因(NM_004994)、GAPDH(NM_001289746)引物，并经过序列比对确定引物序列具有良好的特异性。Trizol法提取HaCaT细胞总RNA(设置3孔实验，取Ct平均值比较)，A260/280比值1.7～2.0之间，严格按照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，然后依据特异性引物(表1)进行Q-PCR检测。PCR反应体系及参数：cDNA稀释10倍后取cDNA 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR®PremixExTaqTM(Tli RNase H Plus，2×)10 μL，ddH2O 4.0 μL，总体积20 μL，用ViiA7扩增仪扩增。反应条件95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 34 s，40个循环。

1.3.3 Western Blot检测Dsg1、Dsg3、MMP-9蛋白表达 6孔板孵育HaCaT细胞，更换各实验组DMEM培养基继续培养18 h，收集细胞，通过裂解、离心、上样、电泳、转膜，5%脱脂牛奶室温摇床封闭2 h。与相应稀释的一抗(GAPDH作为内参)在4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗涤后加入相应的二抗室温摇床孵育1 h。用ECL化学发光法在凝胶成像仪(Bio-rad ChemiDocTM XRS)上观察各自条带。

1.3.4 HaCaT表达Dsg1、Dsg3的荧光单克隆抗体检测 将对数生长期的HaCaT细胞接种于铺有细胞专用爬片的12孔板中孵育，静止4 h贴壁于盖玻片，再更换各实验组培养基继续培养18 h；用PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗5 min后吸干，连续洗3次。接着0.2% Triton-X100 作用 5 min，并以 PBS 清洗后加入 10%山羊血清封闭30 min。加入相应一抗4 ℃孵育过夜。加入二抗后室温孵育1 h。PBS清洗后DAPI室温湿盒避光孵育5 min，荧光抗淬灭剂封片。倒置光学显微镜(OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2)观察细胞形态，倒置荧光显微镜(DMI6000B，Leica)下观察 Dsg3、Dsg1蛋白荧光染色。

1.4 统计学处理

Q-PCR检测的相对模板量RQ=2-ΔΔCT，ΔΔCt=待测样品中目的基因平均ΔCt-参照样品中目的基因ΔCt，ΔCT=目的基因CT-内参基因GAPDH平均Ct。数据以SPSS 20.0软件进行统计分析，不同干预组间mRNA相对表达量的比较用One-way ANOVA，两组间的比较采用Bonferroni检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 含5%PV血清的DMEM高糖培养基HaCaT细胞光镜下形态变化

镜下看出，细胞培养18 h后，基本长成致密单层(图1A)，加入含5% PV血清的DMEM高糖培养基，继续培养18 h，可见老化细胞悬浮，致密单层细胞折光性增强，细胞间联结减弱，细胞游离皱缩、变圆(箭头处)，胞内颗粒变大(图1B)。

图1 HaCaT细胞形态学变化(100×) 1A：正常培养组18 h后； 1B：加入5%PV血清的DMEM高糖培养基继续培养18 h后Fig.1 The morphologic changes in HaCaT cells(100×).1A：Cultured under normal condition for 18 hours;1B：After 18-hour culture in DMEM high glucose with 5% PV serum.

2.2 含5%PV血清的DMEM高糖培养基对HaCaT细胞Dsg1、Dsg3和MMP-9 mRNA转录的影响

通过Q-PCR检测各组HaCaT细胞在不同干预条件下Dsg1、Dsg3和MMP-9 mRNA转录水平,以GADPH为内参基因，结果显示：PV血清组、抗Dsg3单抗组中Dsg1、Dsg3mRNA相对表达量高于正常培养组及健康血清组。PV血清组MMP-9 mRNA相对表达量高于正常培养组(P=0.014)，但与健康血清组比较无明显差异(P=0.154)。与正常培养组相比，PV血清组Dsg1、Dsg3、MMP-9相对表达量分别上升约432%、402%、402%，差异有统计学意义(P值均<0.05)；与抗Dsg3单抗组相比，PV血清组Dsg1、Dsg3、MMP-9相对表达量无明显差异(P值均>0.05)。详见表2。

表2 不同处理组与HaCaT细胞共培养后Dsg1、Dsg3和MMP-9 mRNA相对表达量Tab.2 Expression levels of mRNA for Dsg1, Dsg3 and MMP-9 in HaCaT cells under different culture

2.3 含5%PV血清的DMEM高糖培养基对HaCaT细胞Dsg1、Dsg3和MMP-9的影响

Western Blot结果表明：与正常培养组相比，抗Dsg3单抗组、PV血清组HaCaT细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9 3种蛋白表达均增加，而健康血清组Dsg1、Dsg3、MMP-9表达量未见明显差异，见图2。

2.4 荧光单克隆抗体检测天疱疮患者血清对HaCaT细胞表达Dsg1、Dsg3的影响

用间接免疫荧光法检测各组HaCaT细胞表达Dsg1、Dsg3的影响，用倒置荧光显微镜观察显示：正常培养组和健康血清组HaCaT细胞形态完整，结构类似，荧光强度基本相同，细胞膜表面可见中等强度线状荧光，细胞核染色可见细胞核大，变圆、清晰。Dsg1荧光抗体染色可见PV血清组及抗Dsg3单抗组HaCaT细胞表面线状荧光消失，转而出现颗粒状、团块状荧光颗粒分散于细胞表面和胞浆区域，细胞核缩小，细胞间隙增宽；而Dsg3荧光抗体染色可见PV血清组及抗Dsg3单抗组部分HaCaT细胞表面线状荧光仍然存在，但荧光强度均较正常培养组、健康血清组低，且有细胞核缩小、细胞间隙增宽的现象。PV血清组Dsg1及Dsg3荧光强度较抗Dsg3单抗组低。详见图3。

图2 不同处理组Dsg1、Dsg3、MMP-9、GAPDH 4种蛋白质Western Blot图Fig.2 Expression levels of Dsg1，Dsg3，MMP-9 and GAPDH expression were analyzed by Western Blotting.

图3 单克隆抗体检测不同干预条件下HaCaT表达Dsg1、Dsg-3结果(40×)Fig.3 Immunofluorescence staining of anti-Dsg1/Dsg3 on the surface of HaCaT cells detected by IIF(40×).

3 讨论

PV患者血清中含有Dsg1、Dsg3等多种自身抗体，Dsg“抗体补偿学说”和“空间位阻学说”是目前公认的PV发病机制，而“多点攻击理论”将PV患者表皮棘层松解的机制研究引向深入，且越来越多的证据支持针对表皮细胞间的多重攻击导致了表皮松解，参与多重攻击的因素包括桥粒芯蛋白抗体Dsg1/Dsg3[6]、γδ-T淋巴细胞[5]，以及其他多种非Dsg蛋白如斑菲素蛋白[7]、ATP2C1蛋白[8]、IL-36[9]、线粒体氧化应激异常等[10]。Fujimura等[11]研究发现CD163+组织相关性巨噬细胞(CD163+tissue associated macrophages, TAMs)在PV皮损中有明显浸润，皮损中TAMs相关的调节因子骨膜素蛋白(POSTN)、细胞因子IL-36γ 和MMP-12表达上升，血清中趋化因子CXCL5、可溶性CD163受体水平高于对照组。Schmidt等[12]研究也发现，KC与PV血清孵育可以导致棘层松解。

李惠等[2]研究发现，含Dsg3抗体的PV血清可以降低HaCaT细胞表面Dsg3荧光强度，且抗体量达到1 mg/mL时可使Dsg3表达量下降及棘层松解。据报道，棘层松解存在信号依赖和非信号依赖两种机制[13]，Dsg3荧光降低的原因包括几个方面：一是Dsg3自身抗体与抗原位点结合后阻碍外来抗体的结合，且Dsg3抗体优先与成熟的Dsg3抗原结合导致Dsg3抗原快速枯竭；二是Dsg3抗体结合抗原后，p38MAPK激活、网格动力系统诱导的细胞骨架重组共同引起KC细胞Dsg3内吞；三是Dsg3抗体结合后通过MAPK通路导致Dsg裂解和溶解；四是钙诱导蛋白激酶C介导的KC分化、凋亡过程中MMP-9参与Dsg3降解[14]。因此，Dsg3尽管上调Dsg3 mRNA，促进Dsg3表达，但增加的Dsg3表达被血清中抗Dsg3抗体及KC细胞对Dsg3内吞作用所消耗或抵消。Dsg1、Dsg3单抗这种作用差异是天疱疮抗原补偿机制所不能解释的，进一步说明了PV发病机制的复杂性。

本研究利用含5%PV血清的高糖DMEM培养基孵育HaCaT细胞，探讨了PV血清对细胞形态及表达Dsg、MMP-9的影响。研究显示，PV血清与HaCaT细胞共培养后，细胞收缩，相邻细胞融合不连续，类似棘层松解。研究还显示PV血清可促进Dsg1、Dsg3、MMP-9表达。Dsg1间接免疫荧光检测显示，与正常培养组和健康血清组比较，PV血清组和抗Dsg3单抗组细胞胞浆荧光均呈现为点状或团块状，这种现象可能与Dsg3抗体可以诱使HaCaT Dsg1抗原内吞，导致胞浆内团块或者颗粒状荧光，耗竭细胞表面可结合的Dsg1从而降低细胞表面Dsg1的荧光强度有关[15-17]。与Dsg1不同，PV血清组HaCaT表面Dsg3呈线状表达，细胞浆中未见荧光颗粒，但HaCaT细胞表达Dsg3线状荧光亮度低于正常培养组和健康血清组，说明Dsg3保留在细胞膜上，但可能因为受到Dsg1的位阻作用，抗体不能和抗原适当结合，导致荧光亮度下降。PV血清组Dsg1及Dsg3荧光强度较抗Dsg3单抗组低，可能与PV血清中同时含有Dsg3及Dsg1抗体有关。

MMP是一类锌离子依赖的蛋白酶超家族，参与调节细胞基质平衡，影响疾病的生理和病理过程[18]。MMP可由角质形成细胞、成纤维细胞等多种细胞分泌，分为6类[19]，其中MMP-9属于明胶酶类，主要降解基底膜Ⅳ型胶原。Cirillo等[20]发现MMP-9受PV血清调节，并与PV棘层松解相关。PV中被蛋白水解的Dsg1、Dsg3以及其他重要的钙黏素可能是被某一MMP分开[21]。有报道认为MMP-9参与棘层细胞的凋亡[3]。本研究显示，PV血清促进MMP-9的转录及表达，提示MMP-9参与表皮细胞棘层松解。推测PV抗体结合Dsg抗原后，Dsg蛋白内陷，引起桥粒构象变化，加上斑菲素蛋白结合其自身抗体，使桥粒中Dsg相邻结构松散，触发细胞线粒体氧化应激，P38MAPK炎症通路启动，细胞间桥粒瓦解，细胞皱缩，MMP-9参与角质形成细胞凋亡，细胞间桥粒相继破坏而棘层松解，导致水疱形成。

综上所述，本研究发现PV血清促进HaCaT细胞Dsg1、Dsg3和MMP-9转录及蛋白的表达，同时可以降低HaCaT细胞表面Dsg1、Dsg3荧光强度。但本研究也存在一些局限，如采集PV患者血清后，没有纯化并检测其Dsg1、Dsg3滴度，阳性对照组的效应相比患者血清也更加明显，这些现象是否与共孵育患者血清同时含有Dsg1、Dsg3有关，尚需要进行更深入研究。