褐藻多糖基于PI3k/AKT信号通路对乳腺肿瘤大鼠的效果研究

蒋楠 祝国莲 刘卫霞

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，在世界范围内乳腺癌具有较高的发病率和死亡率，对女性的身心健康产生严重的威胁。进几年临床相关数据显示，我国乳腺癌患者的人数逐渐增加，严重影响人们的生活质量[1]。乳腺癌发病受多种因素影响，且发病机制尚未明确，大量学者研究指出，乳腺癌受机体多种系统调控，和机体细胞及组织结构有紧密的联系[2,3]。目前临床中主要通过手术切除配合放疗、化疗的方式进行治疗，对患者产生的不良反应较大，带来极大的痛苦。褐藻多糖的主要功能是抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、调节免疫、抗血栓等，对于多种肿瘤也有显著的抑制作用[4]。褐藻多糖对多种肿瘤细胞具有促进凋亡和完成自我吞噬的作用，同时可以诱导树突细胞、自然杀伤细胞、T细胞成熟和分化。在体外细胞研究中，褐藻多糖促进细胞凋亡的途径是通过内源性和外源性凋亡机制来完成，同时能够提高化疗药物的疗效。PI3k/AKT信号通路在大部分肿瘤中均表达失调，在肿瘤细胞的增殖和凋亡过程中起到重要的调节作用[5]。郭威等[6]研究指出，PI3k/AKT信号通路作为治疗肿瘤的有效靶点，引起广泛的关注。目前，临床中关于褐藻多糖治疗乳腺肿瘤的相关研究较少，本文旨在研究褐藻多糖通过调控PI3k/AKT信号通路对乳腺肿瘤大鼠的影响，为褐藻多糖的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 研究动物：选取60只雌性、健康Wistar大鼠，年龄6～10周，平均年龄(8.5±0.3)周，体重200～240 g,平均体重(212.3±10.8)g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，大鼠动物合格证号:11401500014592。所有大鼠在无病原菌的干净笼子里喂养，饮用水和食物均进行过消毒。本文研究均经过我院伦理委员会批准。主要试剂：褐藻多糖(购自南京泽朗医药科技有限公司)；PI3k、Akt、PTEN、SHIP一抗和二抗(羊抗鼠一抗和羊抗鼠二抗，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 乳腺肿瘤模型建立及分组:参考文献[7]制作乳腺肿瘤模型，并进行适当修改，60只大鼠随机分为正常组、模型组、低剂量褐藻多糖组和高剂量褐藻多糖组，每组15只。所有大鼠在建模前需要禁食和禁水12 h，采用10%水合氯醛进行腹腔注射，所有大鼠采取仰卧位，将头和四肢进行固定，进行常规消毒。模型组、低剂量褐藻多糖组和高剂量褐藻多糖组大鼠右侧臀部皮下注射DMBA，剂量为100 mg/kg，正常组在同一位置注射等体积的0.9%氯化钠溶液。褐藻多糖以5 mg/μl的质量浓度储存备用。低剂量褐藻多糖组给予褐藻多糖灌胃干预剂量为100 μg/ml，高剂量褐藻多糖组给予褐藻多糖灌胃干预剂量为200 μg/ml。正常组和模型组大鼠给予等体积的无菌0.9%氯化钠溶液进行干预，所有大鼠均需要连续干预2周。

1.2.2 病理学观察:褐藻多糖干预2周后，大鼠颈部脱臼处死后，提取正常组、模型组、低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组大鼠乳腺组织，4%的多聚甲醛进行固定，之后脱水、浸蜡、包埋、制成4 μm厚的切片，之后采取乙醇进行脱水，使用柠檬酸进行抗原修复。脱蜡处理后，进行HE染色。

1.2.3 肿瘤体积、瘤数量、潜伏期统计:取完整处死大鼠腹部皮肤以及大鼠皮下乳腺组织，将包块剔除后，并且对半切开进行观察，统计大鼠包块的数量，使用游标卡尺(精确到1 mm)测量大鼠包块的直径、高度。计算肿瘤体积，公式=长×宽×高×π/6。如果大鼠有多个肿瘤发生，则统计肿瘤体积之和。记录以及潜伏期。

1.2.4 肿瘤细胞的增殖和周期等情况:提取大鼠乳腺肿瘤细胞，进行消化，计数，选择24孔板进行接种，1×104/孔。细胞贴壁后，分别加入2 ml的100 μg/ml和200 μg/ml的褐藻多糖，每组浓度选择18个复孔，每孔中加入2 ml的DMEM培养基，培养0 h、24 h、48 h，统计复孔中的细胞数量。将复孔中的细胞制成单细胞悬液，采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF炎性因子检测:采用酶联免疫吸附试验将50 mmol/L碳酸盐包被缓冲液将抗原进行溶解，浓度为10～20 μg/ml，在96孔酶标板中加入100 μl/孔，4℃过夜保存。第2天舍弃包被液，采用PBST洗涤3次，每孔中加入1%的150 μl BSA，在37℃环境中封闭1 h。之后采用PBST洗涤3次，在每孔中加入100 μl不同倍比稀释度的血清，加入对照样品，37℃孵育2 h。采用PBST洗涤5次，加入100 μl,稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗涤5次，之后，使用显色剂显色20 min后，在酶标仪上读取A405吸收值。分析TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平。

1.2.6 Western blot检测PI3k/AKT信号通路相关蛋白:大鼠组织标本研磨后加入蛋白缓冲液，进行常规蛋白提取，采取BCA法进行定量分析。50 μg的蛋白样品上样后SDS-PAGE电泳，通过蛋白电转到PVDF膜，使用5%的脱脂奶粉TBST中进行避光封闭1 h，洗涤之后加入一抗稀释溶液(PI3k、Akt、PTEN、SHIP按照1∶1 000比例进行稀释)，在4℃的环境中过夜保存，洗涤后加入二抗稀释溶液(PI3k、Akt、PTEN、SHIP按照1∶5 000比例进行稀释)，在温床中孵育1 h后再次洗涤，加入发光液ECL，曝光2～3次，取重叠值。使用软件分析蛋白条带灰度值。GAPDH作内参。

2 结果

2.1 病理学观察 正常组乳腺组织结构表现正常，腺管排列整齐；模型组大鼠乳腺组织细胞结构和层次被破坏，呈现细胞团块结节，大小不一，细胞核表现不一致，有明显的核分裂，大量炎性细胞浸润。低剂量褐藻多糖组和高剂量褐藻多糖组乳腺组织细胞结构和层次恢复，其中高剂量褐藻多糖组恢复明显，炎性细胞浸润显著降低，细胞排列整齐。见图1。

正常组模型组低剂量高剂量

2.2 褐藻多糖对肿瘤体积、瘤数量、潜伏期的影响 与正常组比较，模型组、低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组肿瘤体积、瘤数量、潜伏期较高(P<0.05)。与模型组比较，低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组肿瘤体积、瘤数量降低，潜伏期升高(P<0.05)；与低剂量褐藻多糖组比较，高剂量褐藻多糖组肿瘤体积、瘤数量降低，潜伏期升高差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 褐藻多糖对肿瘤体积、瘤数量、潜伏期的影响

2.3 褐藻多糖对乳腺肿瘤细胞增殖的影响 与正常组比较，24 h、48 h模型组、低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组乳腺肿瘤细胞增殖率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，24 h、48 h低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组乳腺肿瘤细胞增殖率降低(P<0.05)，与低剂量褐藻多糖组比较，24 h、48 h高剂量褐藻多糖组增殖率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 褐藻多糖对乳腺肿瘤细胞增殖的影响

2.4 褐藻多糖对乳腺肿瘤细胞周期的影响 与正常组比较，模型组、低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组乳腺肿瘤细胞周期差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组乳腺肿瘤细胞周期较高，差异有统计学意义(P<0.05)，与低剂量褐藻多糖组比较，高剂量褐藻多糖组G0/G1期低，S期和G2期高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 褐藻多糖对乳腺肿瘤细胞周期的影响

2.5 褐藻多糖对相关炎性因子水平的影响 与正常组比较，模型组、低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平较高(P<0.05)。与模型组比较，低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平降低(P<0.05)；与低剂量褐藻多糖组比较，高剂量褐藻多糖组TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 褐藻多糖对相关炎性因子水平的影响

2.6 褐藻多糖对PI3k/AKT信号通路相关蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组、低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组PI3k、Akt、PTEN、SHIP表达较高(P<0.05)。与模型组比较，低剂量褐藻多糖组、高剂量褐藻多糖组PI3k、Akt、PTEN、SHIP表达降低(P<0.05)；与低剂量褐藻多糖组比较，高剂量褐藻多糖组PI3k、Akt、PTEN、SHIP表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5，图2。

表5 褐藻多糖对PI3k/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

DMBA属于一种致癌剂，具有较强的代谢依赖性，主要作用机制是通过体内代谢活化对DNA产生损伤，细胞发生突变，阻碍细胞分化，细胞异常增生，最终诱导肿瘤产生[8]。本文实验研究是通过对大鼠注射DMBA制剂，诱导大鼠乳腺肿瘤发生。曹加伟等[9]研究指出，DMBA诱导的乳腺癌模型，细胞分化较差且恶性程度高，肿瘤细胞的生物学行为以及肿瘤的病理形态方面与人乳腺癌相似。

本文研究结果显示，模型组大鼠肿瘤体积大、瘤数量较多，潜伏时间短，经过褐藻多糖干预，大鼠肿瘤体积降低、瘤数量减少，潜伏时间延长。说明褐藻多糖能够显著的减小肿瘤体积和质量，从而抑制乳腺肿瘤的生长恶化。张婷等[10]研究指出，褐藻糖胶能够降低乳腺肿瘤大鼠肿瘤发生率和平均瘤重量，延长肿瘤潜伏期。本文研究结果与其保持一致。褐藻多糖可作用于多种肿瘤，例如肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等，促进肿瘤细胞凋亡和自我吞噬，同时褐藻多糖能够促进人单核树突细胞、自然杀伤细胞、T细胞分化和成熟[11]。本文研究结果显示，高剂量褐藻多糖组乳腺肿瘤细胞增长率降低，说明高剂量的褐藻多糖对乳腺肿瘤细胞增殖有抑制作用。高剂量褐藻多糖组G0/G1期细胞数量低，说明高剂量的褐藻多糖能够阻滞乳腺肿瘤细胞的G0/G1期。

TNF-α属于多功能炎性细胞因子，主要由嗜酸性粒细胞以及单核细胞产生，具有抗感染和抗肿瘤的作用。TNF-α通过介导嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞在炎症部位聚集，刺激产生IL-6、IL-8等因子，从而使机体产生持续存在的炎性反应[12]。VEGF属于一种诱导能力较强的因子，作用于血管内皮细胞，刺激细胞的增殖、迁移以及诱导血管的生长，在肿瘤的血管形成过程中起到重要的参与作用[13,14]。Liang等[15]研究显示，VEGF在乳腺癌患者体内呈现高表达。本文研究结果显示，模型组大鼠TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平较高，经过褐藻多糖干预，大鼠TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平降低，其中高剂量褐藻多糖组TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平改善明显，说明褐藻多糖能够有效的抑制乳腺大鼠炎性反应，并且成浓度依赖。褐藻多糖同过降低TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平，抑制乳腺肿瘤新生血管的产生，肿瘤的内部血液供应起到抑制效果，从而抑制乳腺肿瘤增长。

图2 PI3k/AKT信号通路相关蛋白Western blot图

褐藻多糖的来源较为丰富，目前临床中集中在抗凝血、抗病毒、降血脂研究上，关于在乳腺肿瘤的研究较少[16]。王鸿等[17]研究指出，在抗肿瘤、免疫调节等方面具有多种生物活性，通过其内源、外源凋亡机制能够提高化疗药物的作用。PI3K/Akt信号通路对肿瘤细胞启动程序性死亡有抑制作用，促进细胞存活，抑制肿瘤细胞的增殖，同时对正常细胞凋亡也有明显的抑制能力[18]。刘娟妮等[19]研究显示，PI3K/Akt信号通路参与乳腺癌的发生和发展，通过调控相关蛋白表达，促进癌细胞侵袭和迁移。本文研究结果显示，通过Western blot检测发现，高剂量褐藻多糖组PI3k、Akt、PTEN、SHIP表达降低，说明高剂量褐藻多糖对PI3K/Akt信号通路相关蛋白的抑制作用显著，通过抑制其活化，降低大鼠体内的炎性反应，从而起到抑制乳腺肿瘤发生。本文研究结果与王红兵等[20]研究保持一致。

综上所述，褐藻多糖通过调控PI3k/AKT信号通路相关蛋白，抑制肿瘤细胞增殖，阻滞G0/G1期，改善炎性因子水平，对乳腺肿瘤起到显著的抑制作用。