PBEF对缺氧/复氧处理的非小细胞肺癌细胞生长及AQP1和ENaCα表达的影响

尤苗苗，张祖磊，许伟长，芦 潮，龚 艺，杨 威

(1.江西省胸科医院胸外科，南昌 330006； 2.南昌大学a.研究生院医学部2017级； b.第二附属医院心脏大血管外科，南昌 330006；3.赣南医学院第一附属医院心脏大血管外科，江西 赣州 341000)

肺癌是男性中最常见的癌症[1-2]，而非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌(LC)类型，占所有肺癌病例的85%[3]。NSCLC的治疗选择约占所有肺癌的80%，一直是医学上的挑战[4-5]。前B细胞克隆增强因子(PBEF)是具有促进B前体细胞成熟的细胞因子，也称为烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)，它是合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的限速酶[6]。血浆中的PBEF用作急性肺损伤(ALI)的生物标志物[7-8]，在ALI大鼠肺组织中PBEF表达也上调，而PBEF表达的降低则为ALI减轻[9-10]。PBEF可以激活包括NF-κB，细胞凋亡和Toll(Toll样)受体通路，从而影响肺部炎症反应和肺泡液清除(AFC)的效率[11-12]，通过该通路可以维持肺泡上皮细胞与气体接触表面的液膜，以维持气体交换[13]。钠离子主要通过上皮细胞中钠离子通道(ENaC)和Na，K-ATPase的配位，进入肺泡上皮细胞并形成渗透压，从而吸收肺泡液[14-15]。水通道蛋白(AQP)是水进入细胞的途径之一，也是氧气运输的重要通道[16-17]。

缺氧和复氧(H/R)是许多细胞的应激过程，如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)[18]、心肌细胞[19]等，在此过程中多个信号通路被激活，它们彼此相互作用。并且H/R过程在肿瘤微环境中对肿瘤的发生和发展也有影响[20]。有研究[21-22]发现，肺上皮细胞中钠通道蛋白α(ENaCα)的表达受PBEF负调控。MING等[23]发现PBEF在人肺微血管内皮细胞中的过度表达可以抑制水通道蛋白1(AQP1)的表达并促进IL-6、IL-8、TNF-a和其他炎性细胞因子的表达，而PBEF基因的沉默可以增加PBEF的表达；并且他们还发现PBEF通过(MAPK)途径促进肺微血管内皮细胞的凋亡并调节炎症因子和AQP1的表达。NSCLC主要是肺上皮细胞癌变，基于此，本研究通过观察PBEF对H/R处理的NSCLC细胞生长以及AQP1和ENACα表达的影响，探讨PBEF对NSCLC的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

人NSCLC细胞A549(美国典型培养物保藏中心提供)；Dulbecco改良的老鹰培养基、10%胚胎血清(美国Gibco公司)；重组pcDNA3.1质粒、对照荧光素酶载体、脂质体2000、TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒和Trizol试剂(美国Thermo公司)；硝酸纤维素膜(美国Millipore公司)；兔多克隆抗AQP、兔多克隆抗ENaCα、辣根过氧化物酶缀合的二抗(北京博奥森公司)；兔多克隆抗PBEF(上海艾博抗公司)；Annexin-V/碘化丙啶(PI)染色剂(美国BD公司)；PBEF的过表达质粒(上海基因公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染

人NSCLC细胞在Dulbecco改良的老鹰培养基、10%胚胎血清、5%CO2的饱和湿度、37 ℃条件下培养。每2～3 d更换培养基维持细胞并传代培养直到细胞达到70%汇合。将传代培养的NSCLC A549细胞分为4组：对照组(C组)、H/R处理模型组(M组)、H/R处理+pCAGGS空载组(pCAGGS NC组)、H/R处理+pCAGGS PBEF组(pCAGGS PBEF组)。

A549细胞H/R处理：5%CO2、95%N2条件下厌氧培养18 h，然后在正常培养条件下复氧培养24 h。将A549细胞接种在6孔板中进行细胞转染。

使用脂质体2000将携带PBEF开放阅读框(2 μg·mL-1)的重组pcDNA3.1质粒和对照荧光素酶载体(4 μg)转染到H/R处理的A549细胞中。具体方法如下：取2个EP试管，分别向其中加入125 μL Opti-MEM，然后在一个试管中加入5 μL脂质体2000，在另一个试管中加入1 μL质粒和5 μL P3000，轻轻混合，然后静置在室温下放置5 min。将2个管混合并在室温下放置20 min。将混合液滴入六孔板的相应孔中，然后在培养箱中培养。转染4 h后，将细胞加入含20%血清的1 mL完全培养基中。转染后24 h，收集细胞用于以下实验。孵育48 h后，使用定量RT-PCR或Western blot分析确定转染成功情况。

1.2.2 Western blot(WB)检测

在4 ℃条件下，用裂解缓冲液裂解30 min后得到肺癌细胞，以10 000 r·min-1的速度离心10 min后收集上清液。使用BCA方法检测蛋白质浓度。在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白质(每泳道50 μg)，然后电泳转移到硝酸纤维素膜上。在室温下，将膜用5%非脂乳封闭2 h，然后在0.1%Tween 20的TBS中洗涤3次，每次10 min，然后与兔多克隆抗PBEF，兔多克隆抗AQP和兔多克隆抗ENaCα在4 ℃过夜。然后将膜在TBS+0.1%Tween 20中洗涤3次，并与辣根过氧化物酶缀合的二抗一起在室温下孵育2 h。使用增强的化学发光法检测免疫复合物，并通过数量1(4.4-4.6)进行分析。

1.2.3 RT-qPCR检测

使用Trizol试剂从每组细胞中提取总RNA。使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒合成cDNA，并将cDNA用作RT-qPCR的模板。β-肌动蛋白用作标准化的内部对照。反应在96孔光学板中于95 ℃进行10 min，然后在95 ℃进行40循环15 s，在57.3 ℃进行1 min。定量循环(Cq)数据是使用默认阈值设置确定的，Cc定义为荧光通过固定阈值的分数循环数。一式两份进行反应以使每个RNA分离物一式三份。用RT-qPCR计算各组PBEF的相对表达，以β-肌动蛋白为内标。使用的引物序列如下：PBEF-F为CCGACTCCTACAAGGTTACTCA，PBEF-R为TTGGCTTCCTGGAT-TTTCTC；β-肌动蛋白-F为TATCCCTGTACGCCTCTGG，β-肌动蛋白-R为AATGTCACGCACG-ATTTCC。

1.2.4 流式细胞仪定量凋亡

使用膜联蛋白-V/碘化丙啶(PI)染色确定细胞活力，方法如下：膜联蛋白-V/PI表示存活，膜联蛋白-V+/PI表示早期凋亡，膜联蛋白-V+/PI+表示晚期凋亡细胞。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PBEF在A549细胞中成功过表达

pCAGGS PBEF组PBEF mRNA与蛋白表达水平较C组、pCAGGS NC组均显着增加(P<0.05)，见图1。

2.2 PBEF的过表达促进经H/R处理的A549细胞凋亡

M组A549细胞凋亡率显著高于C组(P<0.05)，pCAGGS PBEF组A549细胞凋亡率显著高于pCAGGS NC组(P<0.05)，M组和pCAGGS NC组A549细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)，这表明PBEF的过表达显著加重了H/R诱导的晚期A549细胞凋亡率。见图2。

2.3 PBEF的过表达抑制经H/R处理的A549细胞中的AQP1和ENaCα表达

pCAGGS PBEF组A549细胞中AQP1和ENaCα的蛋白表达水平显着低于pCAGGS NC组(P<0.05)，而C组、M组、pCAGGS NC组3组A549细胞中AQP1和ENaCα的蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，结合A549细胞凋亡结果，可推断AQP1和ENaC与经H/R处理的A549细胞凋亡密切相关。见图3。

3 讨论

本研究结果显示，与pCAGGS NC组相比，pCAGGS PBEF组NSCLC A549细胞中PBEF mRNA增加了约20倍，而PBEF蛋白的表达仅增加了约30%。PBEF是一种细胞因子，也是一种分泌蛋白，可以推断PBEF在A549细胞中过表达，大量PBEF蛋白表达会分泌到细胞微环境中，然后激活分泌细胞和周围细胞的下游途径，表明A549细胞具有很强的分泌PBEF的能力，与MING等[23]的研究结果一致。本研究还发现，在厌氧条件下，A549细胞的凋亡率约为20%，而在相同条件下过表达PBEF则可以达到约70%。众所周知，在NSCLC的治疗中，低氧一直是不利因素，因为癌细胞更适合低氧环境，它们可以变得更具侵袭性，并且对放射疗法更具抵抗力[24-25]。以上结果表明，在低氧条件下，PBEF比正常肺上皮细胞更能促进NSCLC细胞凋亡，PBEF可能具有辅助治疗作用，本研究组将在以后的研究中进行探讨。XIE等[16-17]研究表明，AQP可能在人类LC中起重要作用。本研究发现，在A549细胞中，低氧处理对AQP1和ENaCα的蛋白表达没有明显影响，但是PBEF可以显著抑制它们的表达。

据报道[26]，在低氧条件下，线粒体释放的活性氧氮自由基(RONS)可以促进ENaCα蛋白的泛素化。也有报道[27]显示，高压氧治疗可以促进肺表皮细胞中AQP1的表达并减轻ALI。本研究结果表明，NSCLC细胞中的AQP1和ENaCα对低氧治疗相对不敏感，但是这种情况可能会因PBEF的过表达而逆转，因此可以推测NSCLC可能受PBEF上游基因的调节。总之，本研究可为相关研究者理解PBEF和NSCLC之间的关系提供依据，并为PBEF参与NSCLC的治疗提供可能。