薯蓣皂苷对TNF-α诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜细胞COX表达的影响

魏志萍，刘雅珺，杨树龙

(1.河南护理职业学院生理教研室，河南 安阳 455000； 2.南昌大学基础医学院生理教研室,南昌 330006)

类风湿关节炎(RA)是一种慢性的、系统性的，以滑膜炎为主要表现的自身免疫疾病[1]。成纤维样滑膜细胞(FLS)异常增殖在类风湿关节炎发病过程(滑膜细胞增生，血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏等)中起着至关重要的作用，但其在发病过程中的分子机制仍尚未明确[2]。有研究[3]表明RA患者滑膜组织中环氧合酶(COX)表达明显增加，表明COX在RA的发生和发展中起着重要作用。因此，可以通过抑制COX的表达，达到减轻症状治疗RA的效果。

薯蓣皂苷(Dio)为中国传统中药的常用药材，具有活血舒筋、消食利水、祛痰、截疟的功效，现代研究[4]证实其具有抗炎、抗肿瘤、改善心血管功能、调节免疫等多种药理作用。目前薯蓣皂苷治疗RA的研究较少，而其对FLS作用的研究更是鲜有报道。本实验探讨薯蓣皂苷对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜(FLS)细胞环氧合酶1(COX1)、环氧合酶2(COX2)表达的影响，为薯蓣皂苷治疗RA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

CIA大鼠成纤维样滑膜细胞株(上海研生实业有限公司)，薯蓣皂苷(南京春秋生物公司)，TNF-α(Sigma公司)，DMEM培养基(Solarbio公司)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，GoTaq qPCR Master Mix(Promega公司)，兔抗5-LO(Santa Cruz公司)，兔抗LTA4H(Santa Cruz公司)，兔抗GAPDH(Origene公司)，TRIzol(Takara公司)，GoScriptTM Reverse Transcription System(Promega公司)。ABI7500荧光定量PCR仪(Appleid Biosystems公司)，SDS-PAGE电泳系统(北京六一仪器厂)，GAS 7301B凝胶成像分析系统(BIO-RAD公司)，PCR仪(MJ Resdarch company公司)，多功能酶标仪(Thermo scientifice公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 FLS细胞培养

将CIA大鼠FLS细胞株从液氮中取出进行复苏，复苏后的FLS细胞置于含20%胎牛血清的DMEM培养液中进行常规培养，待细胞长至80%～90%时，使用胰酶消化法进行细胞传代。选取第3—5代细胞用于本实验研究。

1.2.2 TNF-α对FLS细胞活性的影响

选取第3—5代对数期FLS细胞进行计数，以1×104个·(100 μL)-1接种于96孔板继续培养24 h。弃上清液，CON组加入完全培养基，TNF-α各浓度处理组分别加入含不同浓度TNF-α的完全培养基，使TNF-α终浓度分别为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 ng·mL-1，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至24 h。参考相关文献[5]，MTT法检测细胞活性，根据公式计算细胞存活率，实验重复3次以上。

1.2.3 Dio对TNF-α诱导的FLS细胞活性的影响

选取第3—5代对数期CIA大鼠FLS细胞进行计数，以1×104个·(100 μL)-1接种于96孔板继续培养24 h，弃上清液。CON组加入完全培养基，TNF-α组加入含10 ng·mL-1TNF-α的完全培养基，Dio各浓度处理组分别加入含不同浓度Dio+10 ng·mL-1TNF-α的完全培养基，使Dio终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μg·mL-1，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至24 h。MTT法检测细胞活性，计算细胞存活率，实验重复3次以上[5]。

1.2.4 Dio对TNF-α诱导的FLS细胞COX表达的影响

1.2.4.1 实验分组及FLS细胞处理

本实验共分为6组：对照组(CON组)、TNF-α处理组(TNF-α组)、TNF-α+Dio处理1组(Dio 1组)、TNF-α+Dio处理2组(Dio 2组)、TNF-α+Dio处理3组(Dio 3组)、TNF-α+Dio处理4组(Dio 4组)。将FLS细胞1×105个·mL-1接种于6孔板中培养24 h弃上清液，将细胞与10 ng·mL-1的TNF-α共同孵育，CON组加入完全培养基，24 h后弃去培养基。CON组和TNF-α组加入含0.1% DMSO培养基，Dio 1组、Dio 2组、Dio 3组、Dio 4组分别加入1、2、3、4 μg·mL-1的Dio处理细胞24 h。

1.2.4.2 FLS细胞RNA的提取和检测

收集各组FLS细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA。以GAPDH为标准内参，参照promega说明书进行逆转录。荧光定量PCR检测COX2和COX1的表达。COX2引物：上游5′-GCAATTATGAGTTATGTGTT-3′，下游5′-AGTATAATAGGAGAGGTTAGA-3′；COX1引物：上游5′-GGCAGCAGAGTTGGAGGAAT-3′，下游5′-ACTCCGGAGAACAGATGGGA-3′；GAPDH引物：上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′，下游5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3′。

1.2.4.3 FLS细胞蛋白的提取和检测

收集上述各组FLS细胞，按说明书提取细胞总蛋白。采用12%分离胶和5%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，PVDF转模后以含5%牛奶的TBST封闭液中封闭2 h。一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育2 h。一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育2 h。应用凝胶成像系统拍照，通过Image.Pro Plus图像分析综合光密度值，以各组GAPDH作为标准参照，标准化其相应组COX的蛋白表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 TNF-α对FLS细胞活性的影响

CON组，1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 ng·mL-1TNF-α处理组FLS细胞存活率分别为(100.2±1.2)%、(100.5±2.2)%、(100.5±1.1)%、(107.3±1.1)%、(112.0±2.1)%、(110.2±1.3)%、(104.9±1.4)%、(103.3±1.1)%、(101.4±1.2)%；5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 ng·mL-1TNF-α处理组FLS细胞存活率显著高于CON组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果表明，以10.00 ng·mL-1的TNF-α与FLS细胞共同孵育24 h后，FLS细胞存活率最高。因此，本研究选用10 ng·mL-1的TNF-α与FLS细胞共同孵育24 h进行后续试验。

2.2 Dio对TNF-α诱导的FLS细胞活性的影响

CON组，TNF-α组，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μg·mL-1Dio处理组FLS细胞存活率分别为(100.7±0.5)%、(111.7±2.2)%、(109.8±2.4)%、(83.7±0.5)%、(73.3±0.3)%、(56.8±0.5)%、(55.5±0.3)%、(46.0±0.8)%、(41.4±1.6)%、(29.8±0.2)%、(28.4±0.4)%、(23.6±0.4)%；结果显示，当Dio≥1.0 μg·mL-1时呈剂量依赖性抑制TNF-α诱导的FLS细胞增殖，差异有统计学意义(P<0.05)，Dio对TNF-α诱导的FLS细胞的IC50在2～3 μg·mL-1，因此，本研究Dio 1组、Dio 2组、Dio 3组、Dio 4组设定剂量为1、2、3、4 μg·mL-1。

2.3 Dio对TNF-α诱导的FLS细胞COX表达的影响

TNF-α组COX1 mRNA表达水平较CON组显著增加(P<0.01)，Dio 3组、Dio 4组COX1 mRNA表达水平较TNF-α组显著减少(P<0.05或P<0.01)，Dio 1组、Dio 2组COX1 mRNA表达水平与TNF-α组比较差异无统计学意义(P>0.05)。TNF-α组COX2 mRNA和蛋白表达水平较CON组均显著增加(P<0.01)；Dio 1组、Dio 2组、Dio 3组COX2 mRNA表达水平较TNF-α组显著减少(P<0.05或P<0.01)，Dio 4组COX2 mRNA表达水平与TNF-α组比较差异无统计学意义(P>0.05)；Dio 1组、Dio 2组、Dio 3组、Dio 4组COX2蛋白表达水平较TNF-α组显著减少(P<0.01)，且呈剂量依赖性的下调。见表1。

表1 各组FLS细胞COX表达水平比较

3 讨论

RA是公认的难以治愈的系统性自身免疫疾病，临床患者主要表现为关节肿胀、畸形，甚至功能丧失、残疾等，严重影响患者的生活质量[6]。薯蓣皂苷是生产甾体激素类药物的重要基础原，目前已有研究[7]表明在大鼠滑膜细胞系RSC-364的RA疾病模型中，薯蓣皂苷能够通过抑制STAT3蛋白表达和NF-κB p65活性减少VEGF在mRNA的表达，达到治疗RA的作用。此外，在CIA大鼠模型中，薯蓣皂苷能显著降低大鼠足爪组织中TNF-α炎性因子的含量，且能明显降低滑膜组织中COX2表达，从而减少PGE2的合成，发挥抗炎的作用[8]。

COX是合成各种前列腺素的关键酶，COX有两种同工酶，即体内固有的组成型COX1和正常表达极低、经诱导后大量表达的诱导性COX2[9]。NSAIDs作为COX的制剂在临床上广泛应用于RA的治疗，并取得了良好的治疗效果，表明COX在RA的发展过程中具有重要作用。有研究[10]发现，NSAIDs治疗RA的机制主要是由于抑制RA诱发的COX2大量表达，影响PGE2的合成，从而达到治疗效果。同时NSAIDs治疗RA过程中的不良反应主要是由于其对COX1的高度抑制引起的[11]。因此，在探索RA治疗用药的过程中，要保证既能有效抑制COX2的过量表达，又要考虑到对COX1表达无明显影响。本实验结果表明Dio≤3 μg·mL-1时能不同程度地降低TNF-α诱导的CIA大鼠FLS细胞COX2 mRNA和蛋白的表达，表明了其对RA的治疗效果。同时当Dio≥3 μg·mL-1时亦能显著降低COX1的表达，表明当Dio浓度过高时可能产生一定的不良反应，因此在用于RA的治疗时要把握好Dio的用量。但是，在本实验中当Dio浓度为4 μg·mL-1时，COX2 mRNA表达显著升高而蛋白表达显著下降，可能是由于高浓度Dio作用于TNF-α诱导的CIA大鼠FLS细胞时，作用效果与CUGBP2蛋白和COX-2 3′端ARE结合相似，促进mRNA的稳定性的同时抑制其翻译过程，导致蛋白表达降低[12]。这也是后续研究所要解决的问题之一。综上所述，本研究将为临床应用Dio治疗RA提供新的实验理论依据。