调整菌种培养基pH以提高谷氨酰胺产量

解云峰

上海市工业微生物研究所，上海 200233

L-谷氨酰胺是人体内重要而丰富的氨基酸之一，占人体内总游离氨基酸的61%，人体内的L-谷氨酰胺主要生成并储存在肌肉中，是人体健康的必需，在科学和医学领域，得到了越来越广泛的重视和应用[1,2]。为了提高谷氨酰胺的产量，本实验通过对菌种培养基pH进行适当调整，以较大幅度提高谷氨酰胺的产量。

1 材料和方法

1.1 菌种

黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)366[3]。

1.2 培养基

1.2.1斜面培养基

牛肉膏1.0%，蛋白胨 1.0%，NaCl 0.5%，琼脂 2.0% ，pH 7.6。

1.2.2摇瓶种子培养基

葡萄糖 5.0%，尿素 0.5%，KH2PO40.1%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.04%， 玉米浆 3%，pH 7.6。

1.2.3发酵培养基

葡萄糖 12%，KH2PO40.25%，MgSO4·7H2O 0.05%，Mn++10 mg/L，Zn++1.0 mg/L，玉米浆 1%，(NH4)2SO47%(分消)，pH 6.0。

1.3 试剂和仪器

1.3.1试剂

玉米浆(上海葡萄糖厂提供)，PH6.4-8.0试纸(上海试剂四厂产)，L-谷氨酰胺样品(SICMA)，其余均为国产试剂(化学纯)。

1.3.2仪器

721型分光光度计，SKW-3型微量呼吸检压仪，pH计，往复式无节调速摇床(上海工业微生物研究所提供)，发酵罐 NBS公司 SF-116型自控罐配有pH电极和溶氧电极。

1.4 培养条件

恒温箱培养，30 ℃±1 ℃培养斜面菌种，培养1 d。

1.4.1摇瓶种子培养

1 000 mL三角瓶装液量150 mL，接斜面种子一环，置于往复式摇床(110 r/min)，于30 ℃±1 ℃培养12 h。

1.4.216 L自控罐发酵培养

16 L自控罐装液量8 L，118 ℃消毒5 min，冷却后接种量3%～5%，接入发酵罐培养液中，根据试验需要控制pH，风量，转速，溶氧水平等。

发酵过程中，定时取样，检查有无染菌，并测定pH、残糖以及谷氨酰胺产量。

1.5 分析方法

1.5.1菌体生长测定

取1 mL发酵液加19 mL H2O，摇匀后测定610 nm的OD值。

1.5.2谷氨酰胺测定

1.5.2.1纸层析法

发酵液经离心除去菌体等固体物质，在层析纸上定量点样，用谷氨酰胺标准液对照。以正丁醇、冰醋酸、水(4∶1∶1)作展开剂。展开完毕，吹干滤纸，用0.5%茚三酮丙酮溶液显色。洗脱液为0.1% CuSO4·5 H2O ∶75%乙醇(2∶38)，洗脱30 min后在510 nm测OD值，并与标准谷氨酰胺比较，计算样品中谷氨酰胺含量[4]。

1.5.2.2瓦勃氏呼吸仪法

测定样品用碱水解前后的谷氨酸量，然后计算谷氨酰胺含量。

1.6 提高的研究发酵液残糖的测定

采用斐林定糖法。

1.7 pH的测定

用酸度计或精密pH试纸，发酵过程用pH电极测定[4]。

2 实验结果

2.1摇瓶种子培养基pH 7.0时，16 L发酵罐谷氨酰胺生成量(%)的试验结果见表1。

表1 pH 7.0时16 L罐试验结果

2.2摇瓶种子培养基pH 7.6时，16 L发酵罐谷氨酰胺生成量(%)的试验结果见表2。

表2 pH 7.6时16 L罐试验结果

3 小结

实践中发现某些嗜碱性细菌，如果适当提高培养基的pH，使菌种生长得更丰满，就有可能提高其代谢物的生成量。经过对产谷氨酰胺BF.366菌种的实验对比，在16 L罐中，当把菌种斜面培养基和摇瓶种子培养基的pH提高至7.6时，平均产胺达5.94%，与对照pH 7.0时平均产胺5.11%相比较，产胺提高了16%以上。