光催化材料及制品抗真菌性能测试方法的研究

王青柏, 彭如群, 肖惠敏, 刘静霞, 周少璐, 谢小保

广东省微生物研究所，广东省微生物分析检测中心， 广东省科学院，华南应用微生物国家重点实验室，广州 510070

光催化材料及制品因其在光照射激发条件下产生催化作用，发生氧化还原反应，可以长期有效地分解有机污染物和部分无机污染物，具有广谱抗菌、除臭、防污、分解空气及水中有机污染物、自洁、可重复利用等特点，展示其在环境治理、功能建材等方面的巨大应用前景[1-3]。目前研究较多的光催化材料有TiO2，ZnO，Cds，WO3，Fe2O3等，其中TiO2氧化活性较高，化学稳定性好，对人体无毒害，成本低，无污染，应用范围广，因而最受重视，是目前应用最广泛的纳米光催化材料，也是最具有开发前途的绿色环保型材料。TiO2目前广泛应用于光催化空气净化、光催化抗菌、防污自动清洁、大气污染治理、水处理等，如用于陶瓷，玻璃，混凝土，塑料，涂层、纸张等功能产品的生产[4,5]。

然而，光催化材料及制品的抗真菌效果没有标准化的测试和评价方法。本项目的研究，为建立符合我国环境条件和实际应用的紫外光响应的光催化材料及制品抗真菌活性测试方法及评价标准提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器和试剂

生化培养箱、马铃薯琼脂(PDA)培养基、沙氏琼脂培养基，购自广州环凯微生物科技有限公司。

1.1.2实验菌株

标准菌株：黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC 3.5487、嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)CGMCC 3.8028、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231，均购自广东省微生物菌种保藏中心，由本实验室保存。

1.1.3样品

共收集10个光催化样品，从光催化制品或材料上选取平整部分，切成边长为50 mm±2 mm方块，制备6片试样，3片用于光照条件下测试，3片用于暗条件下测试。

采用石英玻璃片作为空白对照样，将空白对照样切成边长为50 mm ±2 mm方块(厚度小于10 mm)，制备9个空白对照样片，其中3片用于0时间洗脱，3片用于光照测试，3片用于暗条件测试。

1.2 实验方法

1.2.1试验菌液的制备

将黑曲霉和嗜松青霉分别接种在PDA培养基上28 ℃±1 ℃培养4 d～7 d，形成良好的孢子培养物后使用；将白色念珠菌接种在沙氏琼脂培养基上36 ℃±1 ℃培养1 d后使用。

取10 mL的稀释液倒入真菌培养物中，用接种环轻轻的刮取真菌及孢子，通过消毒棉或双层纱布过滤，然后将滤液用吸管或涡旋混合器混匀。在显微镜下用血球计数板或比浊法测试得到的真菌浓度，并稀释至(2.0～5.0)×105CFU/mL的浓度。

制备好暂时不用的真菌悬液可在冰箱中(5 ℃～10 ℃)存储，霉菌孢子悬液在冰箱中存储时间不超过24 h，白色念珠菌悬液不超过4 h。

1.2.2接种培养

将空白对照样片和光催化样片分别放入洁净的培养皿中，试验面朝上。用移液管吸取0.2 mL的1.2.1制备的菌液，滴加到每个试样的表面，然后用聚乙烯薄膜(40 mm×40 mm)覆盖。调节薄膜使菌液在样片和薄膜之间分散均匀。注意不要将菌液溢出。

1.2.3培养皿中样片的放置

保湿滤纸铺在培养皿的底部，用适量的无菌水(5 mL～10 mL)浸泡滤纸，然后将玻璃棒置于滤纸上面。将已接种的样片和薄膜小心放在玻璃棒上，用玻璃板盖住培养皿。除了带有薄膜的样片外，所有培养皿里的用品都应经过高压蒸汽灭菌。

1.2.4光照培养

打开光源，稳定30 min，然后调节灯管位置或功率调节光照强度。将需要光照的接种样片(3片光催化样片，3片空白对照样片)置于0.4 mW/cm2～0.8 mW/cm2的紫外光照射培养38 h ±2 h，控制温度在25 ℃±2 ℃，相对湿度不低于85%。

将3个光催化样片、3个空白对照样片置于暗条件下，暗条件的培养温度控制在25 ℃±2 ℃，相对湿度不低于85%，持续培养时间等同光照条件。

2 结果与讨论

2.1 光源

国际上紫外光光响应的光催化产品使用波长一般使用351 nm和365 nm荧光作为激发光源[6]，用对照样片测试波长对真菌孢子或细胞的影响，结果见表1。

表1 紫外波长对真菌孢子或细胞的影响

从表1结果可以看出，351 nm和365 nm荧光对测试菌没有影响，说明365 nm荧光既可以激发光催化材料的催化抗菌活性而本身没有杀菌性能，参考国家标准“GB/T 23763—2009光催化抗菌材料及制品 抗菌性能的评价”[7]，本标准选择365 nm荧光作为紫外光源。

2.2 光照强度

本实验测试了光照强度对真菌孢子或细胞的影响，结果见表2。

表2 光照强度对真菌孢子或细胞的影响

从表2结果可以看出，0.4 mW/cm2和0.8 mW/cm2光照强度对测试菌没有影响，本标准选择0.4 mW/cm2至0.8 mW/cm2作为紫外光光照强度进行试验。

2.3 光照时间

光照强度采用0.8 mW/cm2，光照处理时间对抗真菌试验结果的影响，结果见表3。

表3结果显示光照24 h抗真菌结果较差，光催化材料的抗真菌活性还没有充分发挥作用，光照48 h测试结果都具有抗菌效果，但样品间的结果区分度差，而光照38 h测试结果的区分度较好，测试结果也稳定。因此，光照时间采用38 h最合适。

2.4 方法验证

2.4.1检测人员比对试验

根据确定的试验方法进行了检测人员比对试验，以考核实验方法的重复性，检测结果表明不同的检测人员对同一样品测试结果的重复性较好。人员比对测试结果见表4。

表3 光照时间对真菌孢子或细胞的影响

表4 不同检测人员的比对试验

2.4.2实验室比对试验

同时依据本标准方法，广东省微生物研究所和中科院理化所抗菌检测中心两个不同实验室，使用不同仪器进行了比对试验，比对结果表明(表5)，2个实验室测试的重现性较好，结果相差在误差范围内(微生物的实验误差在15%以内)，试验方法的再现性好，符合微生物抗菌实验的相关要求。

3 结论

本研究以黑曲霉、嗜松青霉、白色念珠菌为测试菌种，真菌细胞或孢子浓度浓度为(2.0～5.0)×105CFU/mL条件下，确定了波长365 nm、辐照强度0.4 mW/cm2至0.8 mW/cm2、光照孵育时间38 h为光催化材料及制品抗真菌性能测试的最佳条件，并对试验条件进行了验证，结果表明本实验方法重复性和再现性良好，为国家标准“GB/T37247—2018光催化材料及制品抗真菌性能测试方法及评价”[8]的制定提供技术了科学依据。

表5 实验室间比对试验