缩合单宁降解方法研究进展

李 特， 宋见喜， 张卓睿， 姜贵全*

(1.吉林省木质材料科学与工程重点实验室,北华大学，吉林 吉林 132013; 2.北华大学 林学院，吉林 吉林 132013)

单宁是一种相对分子质量为500～3 000的天然植物多酚类化合物，按其结构的不同可分为水解单宁和缩合单宁[1]。缩合单宁是以黄烷-3-醇为结构单元通过C4～C6或C4～C8的C—C连接而成的寡聚物或多聚物[2-3]，广泛存在于植物的果、皮中[4-5]。其中，高相对分子质量缩合单宁空间位阻大、透过性差，导致生物活性较低、经济价值小，可通过降解得到相对分子质量较小的单宁低聚体或单体，如抗氧化[6]、抗肿瘤活性较高并在医药、食品、日化用品等方面有广泛应用[7]的儿茶素和抗氧化作用较强的表儿茶素[8]，使其充分发挥抗菌[9-12]、清除自由基[13-15]等作用，从而大大提高其生物活性和生物利用度[16-17]。因此降解对缩合单宁高附加值利用十分重要。近年来，国内外许多研究人员以微生物降解和化学降解为主要降解方法对缩合单宁进行了深入研究，取得了很多成果。本文介绍了近年来缩合单宁降解领域的发展现状，从降解产物的平均聚合度、活性等主要参数入手，讨论微生物降解、酸降解、碱降解、贵金属催化降解、树脂催化降解等对缩合单宁的影响，以期为缩合单宁的降解及高附加值利用提供参考。

1 缩合单宁的微生物降解

1.1 缩合单宁的真菌降解

虽然缩合单宁的结构复杂[18]降解困难，但已有研究表明某些真菌能降解这些多酚类物质[19-20]。在1913年Knudson[21]首次报道单宁可被黑曲霉降解。兰平等[22]用青霉和米曲霉降解葡萄皮单宁，采用薄层色谱分离和分光光度计(香草醛法)相结合的方式进行检测，以葡萄皮单宁的降解产物之一儿茶素质量浓度和转化率为指标，研究不同条件下的降解效果，结果发现：青霉降解效果更好，在培养温度为28 ℃、培养24 h、pH值6.5和单宁质量浓度为12.5 g/L的条件下，儿茶素质量浓度最高可达0.32 g/L，转化率为52.3%。

1.2 缩合单宁的细菌降解

1987年Field等[23]发现缩合鞣质可被厌氧淤泥细菌群降解。McSweeney等[24]首次发现了以缩合单宁为单一碳源的瘤胃细菌，这为之后缩合单宁的细菌降解提供了思路。陈度宇等[25]以牛羊粪为菌源，用梯度驯化法分离筛选到1株能以缩合单宁为唯一碳源生长的肠杆菌属的革兰氏阴性菌，并通过正丁醇-盐酸法和液相色谱法检测儿茶素含量和缩合单宁降解率，72 h时对落叶松单宁的降解率可达90%以上，且有儿茶素生成。这是首次得到可有效降解缩合单宁为儿茶素的细菌，开辟了降解菌的新道路。

2 缩合单宁的化学降解

2.1 缩合单宁的酸降解

酸降解法是缩合单宁降解的主要方法之一，因操作简单、设备价格低廉、降解率高而备受关注。

2.1.1盐酸降解

2.1.1.1降解原理 Matthews等[26]在HCl存在下以间苯三酚和苄基硫醇为亲核试剂分别降解缩合单宁，研究发现缩合单宁末端基团以儿茶素和表儿茶素形式释放，延伸端形成加合物(图1)，通过高效液相色谱(HPLC)等检测可知苄基硫醇为亲核试剂时降解率更高，为之后酸降解奠定了基础。

图1 单链型缩合单宁降解原理图[26]

2.1.1.2盐酸单独降解 魏冠红[27]选用HCl、1号强酸性树脂和冰醋酸分别降解葡萄籽缩合单宁，经HPLC分析HCl降解产物发现在单体和低聚体集中出现的保留区无明显的吸收峰，说明HCl不能使高聚体降解为单体和低聚体，可能由于HCl酸性较强；冰醋酸降解产物平均聚合度由6.31降至3.82，但没降到1～3之间，可能由于冰醋酸酸性较弱；1号强酸性树脂降解产物平均聚合度由6.26降至2.30，达到了聚合度1～3的要求。文魁山[28]同样用HCl降解葡萄籽缩合单宁，纯HCl降解产物平均聚合度由5.65降至4.57(效果不显著),原因是HCl中H+只能促使缩合单宁链接末端解离出非常小部分的单体，很难与碳正离子形成二聚体,在无亲核试剂的情况下碳正离子中间体重新生成高聚体，导致低聚体很难被检测到。因此，仅依靠HCl很难使缩合单宁得到有效降解。

2.1.1.3亲核试剂表儿茶素/HCl降解 相对分子质量大的缩合单宁在降解过程中会产生一种不稳定的碳正离子中间体，若没有亲核试剂的存在则会沿着逆反应重新生成大分子物质，而黄烷-3-醇作为缩合单宁的单体，当以它为亲核试剂时，并不会引入新的杂质，因此以黄烷-3-醇为结构单元的儿茶素和表儿茶素也可作为理想的亲核试剂。近几年，亲核试剂表儿茶素(EC)/HCl降解缩合单宁很受欢迎，在不引入杂质的条件下，不仅降低了产物的平均聚合度，而且有一定的选择性。Qi等[29]用EC/HCl降解高粱缩合单宁，在74 ℃、pH值1.24、反应61min、EC与缩合单宁质量比值0.89的最优条件下，儿茶素、EC和低聚体总产率达(86.0±1.2)%。齐亚静[30]以表儿茶素为亲核试剂，在盐酸存在下降解高粱缩合单宁，经NP-HPLC离子源串联质谱(MS)法同样检测出产物中有缩合单宁单体、二聚体、三聚体等。文魁山[28]用EC/HCl降解葡萄皮缩合单宁，平均聚合度从5.65降至1.74，可定向降解为更有价值的原花青素B2。

2.1.1.4其他亲核试剂降解 研究人员还对其他亲核试剂进行了探索[31]，Zhang等[32]以2-巯基乙醇为亲核试剂，在HCl存在的条件下降解落叶松树皮缩合单宁，通过红外光谱表征得出解聚产物为儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素等。文魁山[28]用儿茶素/HCl降解葡萄籽缩合单宁，以降解产物的平均聚合度为检测指标并通过UPLC判断产物成分，结果为：平均聚合度降低了3.97个单位(效果显著)，可定向降解为原花青素B1。Billerach等[33]分别探讨了以薄荷呋喃、间苯三酚和2-巯基乙醇为亲核试剂，在HCl条件下对原花青素B2的降解效果，在40 min内原花青素B2几乎完全被薄荷呋喃降解(降解率>98.8%)，降解产物表儿茶素-薄荷呋喃的产率为91.6%，EC产率为88.1%；而其他2种亲核试剂降解效果均不理想，反应平衡时只降解了部分缩合单宁，降解产物表儿茶素-间苯三酚发生了逆反应，产生的新低聚物影响了原有的平衡(图2)。研究人员进一步探讨了这3种亲核试剂对更复杂葡萄籽缩合单宁的降解效果，结果发现：MF、PG和2-巯基乙醇与含缩合单宁的葡萄籽提取物质量比分别为1 ∶1、10 ∶1和55 ∶1时，能快速完全降解单宁。该研究证明了薄荷呋喃降解缩合单宁的潜力，MF不仅易得，而且效率高、无显著逆转。

图2 缩合单宁的亲核试剂降解(以薄荷呋喃获得的产品为例)[33]

2.1.2亚硫酸降解 张惠[34]用甲酸、醋酸和亚硫酸分别降解莲房缩合单宁，结果发现：甲酸和醋酸仅使莲房缩合单宁平均聚合度由5.95分别降至4.24和4.63，降解效果不显著；而以亚硫酸为降解剂，在反应温度80 ℃、反应时间50 min的条件下，平均聚合度由5.95降至3.04。Luo等[35]用亚硫酸降解葡萄籽及皮中的缩合单宁，在温度60 ℃、反应时间60 min、样品与亚硫酸质量比为1 ∶0.2条件下，共得到10种二聚体或三聚体原花青素，其中大多数产量高、纯度高(90%以上)。

2.2 缩合单宁的碱降解

碱法降解成本低、操作简单，缺点是降解条件不易把控。White等[37]意外发现原花青素在一定浓度NaOH作用下产生1%的单体和5%的二聚体。纪秀凤等[38]探索了NaOH、Na2CO3、NaHCO3、NaHSO3、Na2SO3对红树莓籽缩合单宁的降解效果，结果表明：Na2SO3降解效果最佳，当碱液质量分数2.13%，反应时间42 min，温度60 ℃时，平均聚合度由5.44降至2.14±0.11，降解前高聚合度的缩合单宁对α-葡萄糖苷酶(α-Glu)和α-淀粉酶(α-Amy)的IC50值分别为0.730和0.578 g/L，降解产物对α-Glu和α-Amy的IC50值分别为0.291和0.342 g/L，降解产物儿茶素、表儿茶素及其聚合体对α-Amy和α-Glu活性的抑制作用更高，该发现为降血糖新药物的开发提供了依据。Liu等[39]研究了不同NaOH/尿素配比的混合水溶液对马占相思单宁的解聚效果，结果表明：缩合单宁的重均分子质量从1 725和704 u下降到1 523 和327 u，平均聚合度从7降至2，主要原因是C4—C8断裂以及一些C4—C6、醚键被破坏(图3)。张杰等[40]探索了NaOH对霞多丽葡萄籽缩合单宁(原花青素)的影响，在NaOH浓度10 mol/L，预处理温度60 ℃，处理时间15 min的最优条件下，原花青素平均聚合度由5.39±0.12降至1.30±0.014。

图3 NaOH降解机理示意图[40]

2.3 缩合单宁的贵金属催化氢解

氢化降解缩合单宁的方法对安全性要求较高，但操作方便简洁，对仪器设备腐蚀小。由于缩合单宁A环的C8位为亲核中心，C环的C4位为亲电中心，因此通过贵金属催化和氢气氢解将C4—C8断裂，从而使相对分子质量大的缩合单宁催化氢解为儿茶素、表儿茶素和相对分子质量小的缩合单宁。在1982年Foo[41]成功以贵金属为催化剂对光叶石楠中缩合单宁进行降解，这为缩合单宁的降解提供了新思路。杜晓等[42]用Pd/C催化氢解落叶松树皮缩合单宁(多聚原花青素)制备低聚原花青素，产物主要为儿茶素、表儿茶素和原花青定B1等，清除3种氧自由基(超氧自由基、羟基自由基、脂类自由基)的能力明显高于降解前， IC50分别为0.048、8.06和0.19 g/L。姜贵全[43]也做了相似的实验并分析了降解机理，催化剂Pd/C通过破坏缩合单宁的C4—C8实现对缩合单宁的降解，降解产物平均聚合度由7.99降至2.66，降解率为67.46%。Li等[44]用Pd/C催化氢解高粱麸皮缩合单宁，低聚物产率最高为38.8%，剩余聚合物为16.6%。Zhu等[45]提供了一种新方法，用低成本的Ru/C催化氢解落叶松树皮缩合单宁,结果表明：在反应温度150 ℃，反应时间1 h，Ru/C负载量为1%时，降解率可达74.1%，降解物清除ABTS自由基的IC50值为0.032 g/L,优于常用的氧化剂。

2.4 缩合单宁的生物酶解法降解

Osman等[46]研究发现漆酶可将原花青定B2降解为原花青定A2二聚体和其他醌类氧化产物，漆酶首先氧化一个酚羟基，然后从2号碳中提取电子进行去质子化反应形成中间体醌甲基化物；较低的黄烷-3-醇单元的7号碳的羟基在较高单元的2号碳处的亲核反应导致原花青定A2的形成。2016年苏惠娟[47]成功筛选出N-乙酰神经氨酸裂解酶用于降解葡萄籽缩合单宁。试验将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的nanA基因片段构建在3种不同质粒上形成重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)表达,经镍柱纯化得到N-乙酰神经氨酸裂解酶；然后用此酶降解葡萄籽高聚缩合单宁并优化降解条件，结果表明：反应温度50 ℃、pH值10、反应8 h条件下，得到35.67 mg/g单体和14.49 mg/g二聚体。这是一种全新的绿色生物降解法，降解得率高、催化效率快，极具发展潜力。

3 缩合单宁的树脂催化降解

2018年姜贵全等[48]探讨了CR57树脂催化降解落叶松树皮缩合单宁制备低聚原花青素，每100 mL多聚原花青素中加入18 mL树脂，反应温度76 ℃、反应1.8 h，在此条件下降解产物的平均聚合度为3.76，经色谱和MS检测可知，产物中含儿茶素、表儿茶素、原花青素B1等，降解机理为CR57树脂是球状大孔强酸性阳离子交换树脂，类似于固体酸，其良好的大孔网状结构和较优的催化活性使缩合单宁能够进到球体内部与H+反应，H+进攻单宁A环C8位形成碳正离子，C环的C4位为亲电中心，使单宁单元C4—C8断裂生成低聚体；降解产物清除DPPH·、·OH和ABTS·的IC50值分别为 72.56、12.64和2.52 mg/L，其能力略低于葡萄籽提取物，高于Vc。树脂催化降解法操作简便、对仪器腐蚀性小、成本低、反应条件温和，是绿色高效的降解新方法。

4 结语与展望

通过对缩合单宁降解的研究历程分析得出：1) 目前已有大量研究证明缩合单宁可被降解为生物活性更高的小分子单体或低聚体，这对缩合单宁的高附加值利用具有非常深远的意义。2) 微生物降解法虽环保、成本低，但很难寻找合适菌株且不确定性很高。酸降解法因操作简单、降解率高、对设备要求低等优点广泛应用于缩合单宁的解聚反应，如以盐酸加表儿茶素或儿茶素亲核试剂作为降解剂，既不引入杂质，又可以选择性生成目标产物；但酸降解的不易回收性会造成工业污染，不利于环保。碱降解法反应速率快、产量高、成本低廉，但可能存在着单宁降解与自缩聚的竞争反应，导致降解量很小。3) 贵金属催化降解法因操作简便、定向生成低聚体等优点在催化、化学、能源等领域广泛应用，但不可忽略的是降解反应条件苛刻，且贵金属成本高。因此制备更绿色环保、可回收、反应条件温和、稳定性高的催化剂是亟待解决的问题。

目前大部分研究者集中于研究酸降解和贵金属催化降解法，但贵金属成本较高，可采用向少量贵金属中掺入过渡金属的方法降低成本(如向Pd中加入Fe或Cu)，再结合固体酸(如硫酸化氧化锆)以便于催化剂的回收和重复利用。另外，生物酶解法因无污染、得率高等优点被视为环境友好型技术，未来可通过DNA重组技术克隆单宁酶及基因进一步研究可靶向降解、友好、环保的高活性、耐高温的单宁酶。