养心定悸胶囊预处理对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响

程浩 汪雁博 郝国贞 姜云发 支伟 王庆

急性心肌梗死的病理生理学机制是冠状动脉血供急剧减少或中断导致的心肌坏死[1]。再灌注治疗是急性心肌梗死的核心治疗，其目标是恢复冠脉血流，保证心肌灌注，缩小梗死面积，改善患者预后。近年来，人们在临床中尝试采用多种再灌注治疗方式，以期改善梗死区域心肌灌注水平，减少心肌梗死面积，然而其治疗策略仍有待进一步探索和优化[2]。养心定悸胶囊的处方来源于《伤寒论》中的经典名方炙甘草汤，主要组方包括炙甘草、桂枝、地黄、麦冬、红参、芝麻、生姜、大枣、阿胶九味药材，具有益气养血，滋阴复脉之功效，在治疗“心动悸、脉结代”方面具有良好的效果[3]。既往研究结果发现，养心定悸胶囊的主要成分如炙甘草、桂枝、麦冬等均具有抗血栓、抗炎和抗心律失常等心脏保护作用，可有效降低缺血心肌细胞的炎性反应水平，进而减少心肌缺血再灌注损伤[4]。养心定悸胶囊也已在临床中用于急性心肌梗死并发心律失常的防治。本研究观察养心定悸胶囊预处理对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 本研究使用由辽宁长生生物技术有限公司提供的健康雄性SD大鼠[许可证号：SCXK(辽)2015-0001]30只作为实验动物，6～8周龄，体重250～300 g，温度(22±1)℃，湿度45%～55%，自由进食饮水。适应性喂养1周后建立模型。

1.2 药品和仪器 (1) 药品：使用养心定悸胶囊(石药集团河北永丰药业有限公司，0.5 g/粒)配置溶液，灌胃使用。(2)主要仪器：超纯水系统(星号：NW10LVF，香港Heal Force)、-70℃超低温冰箱(型号：DW HL-668，安徽中科美菱)、微量移液器(型号：Proline，苏州BIOHIT)、酶标仪(型号：ELX-800，美国BIOTEK)、紫外可见分光光度计(型号：Proline，苏州BIOHIT)、数显恒温水浴锅(型号：HH-4 金坛，荣华仪器)、电热恒温培养箱(型号：DH36001B，天津天津泰斯特)。(3) 主要试剂：0.9%氯化钠溶液(中国都邦药业)、PBS(货号：P10033，中国双螺旋)、TTC(货号：T109275，中国阿拉丁)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：WLA004，中国万类生物)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)测试盒(货号：E006，中国南京建成)。

1.3 动物模型制备 将大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和养心定悸组，每组10只。(1) 假手术组：大鼠缝线不结扎，其他操作与模型组相同。(2)模型组：将大鼠给予同养心定悸组相同体积的0.9%氯化钠溶液进行灌胃处理，3次/d，连续7 d，手术操作同养心定悸组。(3)养心定悸组：将大鼠用0.1 mg/g的养心定悸溶液(石药集团河北永丰药业有限公司，0.5 g/粒)进行灌胃给药；3次/d，连续7 d。随后腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠固定于手术台上，仰卧位。颈部去毛消毒，剪开皮肤暴露气管，连接至呼吸机行机械通气，设置呼吸频率80次/min，潮气量6～8 ml/kg，呼吸比为2∶1，根据具体呼吸频率及深度适当调整呼吸参数。左前胸去毛消毒，顺肋间隙方向，胸骨左侧切开皮肤约1～1.5 cm，分离皮下组织和肌肉，入胸后推开胸腺，暴露心脏及大血管根部。剪开心包，在左心耳下缘与肺动脉间可见左冠状动脉前降支起始部，在距离主动脉根部约3～5 mm 处，以左冠状静脉为标志，用尼龙缝线结扎造成缺血，缝合皮肤，计时器计时45 min。打开尼龙缝线，使血液流通，复灌3 h。模型建立3 h后，同步处死各只大鼠，收集心肌组织及颈静脉血(分离血清)，进行后续实验。

1.4 病理组织学观察 模型建立3 h后，从右颈动脉注入1% Evans blue 3 ml/kg，区分缺血区和非缺血区心肌。随即取下整个心脏，以磷酸缓冲液(PBS,pH值7.4)冲洗，剪去心房，心室部分垂直于长轴横切成4～6块1～2 mm厚的心肌片，置于1%氯化三苯基四氮唑 (2,3,5-Tripheny-ltetrazoliumchloride,TTC)溶液，37℃孵育12 min，将活的心肌组织染成砖红色。经 TTC染色的心肌厚片固定于10%缓冲中性甲醛溶液24 h。每片心脏用滤纸吸干后称重。双面彩色扫描，图像输入电脑保存。扫描后的心肌片保存在甲醛滤液内，随后石蜡包埋。非缺血区已由苔酚蓝染成蓝色，缺血危险区内包括砖红色的存活心肌及未被染色的灰白梗死组织。根据心肌厚片表面的三种颜色，用电脑图像分析软件(Photoshop 7.0和计算不规则多边形面积软件 2.0.4)分别测定双面梗死区面积和缺血区面积占整片心肌切面的百分比。

1.5 心肌损伤标志物测定 准确称取心肌组织重量，按重量(g)∶体积(ml)=1∶9的比例加入9倍的0.9%氯化钠溶液，冰浴条件下机械匀浆，2 500 r/min，离心10 min，制备成10%的匀浆上清液。将心肌组织匀浆上清，BCA法进行肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)蛋白含量测定。每个治疗组的心脏组织匀浆后，根据制造商的说明(Life Span Bio Sciences,Inc.,Seattle,WA,USA)通过ELISA测量肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)，丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的浓度。

2 结果

2.1 3组大鼠心肌梗死面积比较 3组大鼠周龄及体重比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具备可比性。3组大鼠依照分组进行处理后，迅速取下心脏，进行TTC染色后，大鼠梗死区心肌呈现白色，非梗死曲为暗红色，对比较明显。假手术各组心肌均呈现暗红色，无白色梗死区域出现。与假手术组相比，模型组大鼠心肌梗死面积显著增加[(36.59±10.17)%]，而给予养心定悸溶液预处理的大鼠，心肌梗死面积较模型组显著减小[(23.42±8.26)%]，差异有统计学意义(P=0.0052)。见图1，表1。

图1 3组心肌梗死面积比较

2.2 3组心肌损伤标志物比较 与假手术组比较，模型组和养心定悸组大鼠血清CK-MB、LDH均显著增高(P<0.01)，提示缺血/再灌注损伤导致心肌细胞膜损伤，导致心肌坏死标志物漏出。预防性应用养心定悸溶液后，养心定悸组大鼠CK-MB较模型组显著降低(P<0.01)。养心定悸组大鼠LDH与模型组比较显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠心肌梗死面积和心肌损伤标志物水平变化

2.3 3组炎性反应标志物水平的变化 与假手术组相比，养心定悸组和模型组的TNF-α、IL-6和MDA含量均升高(P<0.01)，而养心定悸组的TNF-α水平低于模型组(P<0.05)。模型组和养心定悸组的SOD水平较低(P<0.01)，养心定悸组平高于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 3组炎性反应标志物水平的变化

3 讨论

缺血再灌注损伤是临床治疗急性心肌梗死面临的重要问题和挑战，对于患者心肌梗死面积和预后将产生深刻影响。既往多项研究表明，多种因素参与了缺血再灌注损伤发生发展的重要病理生理学机制，例如氧化应激损伤、炎症反应和心肌细胞凋亡等等。目前，许多专家在药物和非药物预防心肌缺血再灌注损伤方面进行了深入探索[5,6],但是笔者发现针对急性心肌梗死再灌注治疗后心肌保护的有效措施尚无定论。本研究采用经典的结扎前降支的方法制备大鼠心肌梗死模型[7,8]，制作时将结扎部位选择在左心耳下缘与肺动脉间可见左冠状动脉前降支起始部，该方法操作简单、成功率高且与临床AMI 症状接近，成模率和存活率高，为研究的顺利进行提供了保障。本研究结果发现，养心定悸胶囊预处理可能具有减少缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积的作用，这一作用可能与其抑制再灌注过程中的炎症反应有关。

当心肌持续缺血时，多种炎症细胞激活，释放炎性因子，引起心肌炎症损伤，从而进一步加重心肌缺血和缺血再灌注损伤。心肌缺血产生大量的氧自由基，这些氧自由基作用于细胞膜上的不饱和脂肪酸，并形成氧自由基脂质过氧化MDA的最终产物[9]。 因此，MDA的水平可以反映心肌损伤的程度。SOD是心肌中重要的抗氧化酶，可以清除氧自由基并抵消MDA的损害，具有减轻缺血/再灌注损伤的作用[10,11]。本研究中，与模型组相比，养心定悸组大鼠MDA水平减低，SOD水平升高。提示养心定悸胶囊可能通过清除氧自由基减轻氧自由基对再灌注损伤的影响，进而减少心肌梗死面积。TNF-α和IL-6与心肌缺血-再灌注损伤密切相关[12]。心肌细胞在缺血再灌注过程中可合成和分泌大量的TNF-α，后者是心肌缺血再灌注损伤炎症反应中的关键介质，可通过不同途径导致心肌细胞损伤、溶解、甚至死亡[13]。IL-6在调节炎症反应中处于关键位置，在心肌缺血-再灌注损伤中也起到了重要作用[14]。本研究结果发现，经过养心定悸胶囊预处理可能是通过降低TNF-α 和IL-6 水平的机制来减轻缺血心肌的炎症反应，从而减轻了心肌缺血再灌注损伤的程度。

冠心病属于中医学“胸痹”、“心痹”范畴，发生机制为气滞血瘀、心脉痹阻。先前的基础和临床研究表明，冠心病心绞痛患者具有典型的血瘀证表现，治疗方法以宣痹通阳和补益气阴为主。既往研究证实，临床应用炙甘草汤治疗不稳定型心绞痛具有良好的效果，能够明显改善心绞痛患者的临床症状。养心定悸胶囊收载于《中国药典》2015版和《新药转正标准》中，由炙甘草、桂枝、地黄、麦冬、红参、芝麻、生姜、大枣、阿胶共计九味中药材组成，具有益气养血，滋阴复脉之功效，已经被广泛应用于各种疾病导致的心律失常的治疗，可以显著改善患者的临床症状，具有良好的临床疗效[15]。本研究发现应用养心定悸胶囊预处理可以使心肌梗死大鼠的梗死面积减小，因此具有一定程度的心肌保护作用。

养心定悸胶囊组方中桂枝味辛温，善温经、通脉、通阳化气；甘草味甘平，能益气复脉，两者配伍，为临床“辛甘化阳”的经典药对。其组方中的甘草中甘草酸类成分甘草酸和黄酮类成分甘草苷具有抗血栓、抗炎、抗心律失常、心肌细胞保护作用，可有效改善心肌细胞炎症反应，减轻心肌缺血再灌注损伤的程度[16,17]。桂枝中的主要活性成分桂皮酸和桂皮醛具有降压、抗炎、抗血小板聚集和抗凝血等多种药理作用[18]，因此我们可以推测甘草酸、桂皮酸和桂皮醛等可能均参与了心肌缺血再灌注损伤的保护作用。其他成分如大枣、麦冬、红参和生姜也具有一定程度的抗氧化作用[19,20]。本研究中，经过养心定悸胶囊预处理对心肌梗死大鼠的心肌保护作用可能与养心定悸胶囊上述综合的药理作用有关，但具体作用机制仍需要深入探讨。

总之，养心定悸胶囊制备的溶液预处理对急性心肌梗死大鼠具有一定的心肌保护作用，该作用可能与养心定悸胶囊预处理减少缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积，抑制心肌梗死后炎性反应有关。但由于样本量较少，观察指标仅限于炎症反应方面，而未行养心定悸胶囊对心肌细胞凋亡及其他可能的机制更为全面深入的研究，也未对养心定悸胶囊心机保护作用的核心组成成分进行分析，因此有待于更多的观察和分析。