敌百虫-D6同位素丰度的快速测定及计算

盛立彦，李美华，杜晓宁

(上海化工研究院有限公司 上海稳定同位素工程技术研究中心，上海 200062)

近年来，随着色谱-质谱联用技术以及稳定同位素标记试剂的普及，同位素稀释质谱法在食品安全检测领域得到越来越广泛的应用[1-7]。质谱法拥有极高的灵敏度及检测专一性，而同位素内标则最大限度地消除了在前处理及色谱定量环节产生的误差，并能避免质谱的基质效应，使得同位素稀释质谱法被公认为最准确、灵敏的分析方法[8-11]。如今，越来越多种类的稳定同位素标记试剂能通过有机合成法[12-16]甚至生物发酵法制备[17]，而化学纯度(Chemical Purity)及同位素丰度(Isotope Enrichment)是其两个重要的技术指标[18]。尤其是同位素丰度，低标记率内标物可能反而干扰目标物的检测，从而影响定量分析的准确性。

目前，稳定同位素标记试剂的同位素丰度测定方法以有机质谱法为主。郑波等[18]提出采用液相色谱-质谱法表征美沙西汀-13C，将样品引入到液相色谱进行分离，并对美沙西汀色谱峰中部分质谱数据进行“质量簇”法归类处理，计算得到美沙西汀-13C的同位素丰度。蔡银萍等[19]采用类似的方法对5个氘标记的苏丹红I-D5进行了同位素丰度测定及计算，并进行了方法学验证。雷雯等[20]与侯捷等[21]则将“质量簇”法与气相色谱-质谱联用技术结合，分别分析了血液中及精氨酸发酵液中的氨基酸同位素丰度。但上述方法的数据处理中，未对如何在色谱峰上选取更有代表性的质谱图开展研究。相比之下，若采用蠕动泵将样品引入质谱，则能获得更平稳的离子流及差异更小的质谱图。因此，在现行的化工行业标准中[22]，均规定了利用蠕动泵将样品引入质谱，并采用“质量簇”法对稳定同位素标记试剂如沙丁胺醇-D3、恩诺沙星-D5、敌百虫-D6等的同位素丰度进行表征。然而，采用蠕动泵引入样品需要耗费大量的时间——尤其是连续进样相对分子质量相同或相近的样品时，为了克服质谱的记忆效应，每两次进样之间需要多次用溶剂冲洗质谱的管路及离子源。另外，“质量簇”法中解多元线性方程组的环节也不利于大量样品的数据处理。

本研究对照HG/T 4850.4，提出了一种采用液相色谱-质谱联用法测定敌百虫-D6同位素丰度的方法，并针对如何在色谱峰中选取合适的数据以使测定结果与蠕动泵法等效开展了研究。用液相色谱代替质谱蠕动泵引入样品，能极大地减少人工操作环节，避免在连续样品测试过程中主观判断带来的影响(例如溶剂冲洗多长时间、何时开始采集数据等)，并能加快样品分析的速度。同时，本研究优化敌百虫-D6同位素丰度计算方法，拟通过数学推理，用一个简单的公式代替标准中规定的解七元一次方程组的步骤，以降低数据处理时间。

1 实验材料

1.1 主要试剂

敌百虫-D6：分析标准品，化学纯度≥98.0%(HPLC)，Sigma-Aldrich公司产品；甲醇：HPLC级，德国Merck公司产品；甲酸：HPLC级，CNW公司产品；超纯水为实验室自制。

1.2 主要仪器

TSQ Quantum-Accela型液质联用仪：美国ThermoFisher公司；Milli-Q型纯水机：德国Merck公司。

2 实验方法

2.1 工作溶液的制备

精确称量敌百虫-D6标准品5 mg，用1 mL甲醇溶解定容，制成约5 g/L的标准贮备液，并用甲醇将其逐级稀释至1、0.1、0.01、0.001 g/L工作溶液备用。

2.2 液相色谱-质谱条件

色谱条件[23]：采用岛津公司的Shim-pack GIST C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相A为甲醇，流动相B为含0.1%甲酸的水溶液(V∶V)，采用VA∶VB=90∶10等度洗脱，流速为200 μL/min；进样量为10 μL。

质谱条件：离子源采用ESI+模式，电喷雾电压(Spray Voltage)为3 500 V，鞘气 (Shealth Gas)流速为13 L/min，离子传输管温度为275 ℃，扫描模式为全扫描(Full Scan)模式，扫描分辨率选择为0.4 Da，采集的质荷比范围为m/z=250～280 Da，扫描时间(Scan Time)为0.5 s。

若由蠕动泵直接进样而不通过液相色谱分离，则参照标准要求，样品引入速度为10 μL/min。

2.3 质谱数据的选取

采用蠕动泵引入样品时，在获得稳定的离子流图(TIC)后，采集10 s数据(20张质谱图)并取平均质谱图峰强度进行计算。

采用液相色谱引入样品时，选择以待测物保留时间为中心前后19张质谱图进行叠加平均，并进行计算。

2.4 敌百虫-D6同位素丰度计算方法(“质量簇”法)

敌百虫-D6的质谱峰簇(m/z=257～269)对应的分子式应为(C4H3D6O4Cl3P)+，则其未经过氘标记的部分对应的元素组成应为(C4H3O4Cl3P)+，其天然丰度分布的占比(归一化后)应为A251∶A252∶A253∶A254∶A255∶A256∶A257=0.412∶0.019∶0.399∶0.018∶0.130∶0.006∶0.015。

将所采集到的质谱图中m/z=257,258,259,260,261,262,263的峰强度数据分别记为A0,A1,A2,A3,A4,A5,A6，代入以下方程组(1)计算，解xj(j=0,1,2,3,4,5,6)。

(1)

敌百虫-D6的同位素丰度值以E表示，按式(2)计算：

(2)

2.5 敌百虫-D6同位素丰度快速计算方法(线性公式法)

敌百虫-D6的同位素丰度值以E表示，按式(3)计算：

E=(-0.251A0+0.185A1+0.324A2-

0.290A3-0.338A4+0.787A5+A6)/

(0.291A0+0.623A1+0.653A2+0.033A3-

0.012A4+0.954A5+A6)×100%

(3)

3 结果与讨论

3.1 同位素丰度计算方法的简化

3.1.1“质量簇”同位素丰度计算方法

“质量簇”法的同位素丰度计算方法一般分为三步：第一步为通过理论计算、模拟器或未标记的对照品实测结果得到待测分子未标记部分的天然同位素分布α0,α1,α2,…,αn；第二步为通过解线性方程组(如方程组1)将质谱数据去卷积，即扣除各质荷比质谱峰强度中由非同位素标记部分天然同位素丰度分布带来的贡献，还原得到不同标记数待测物摩尔分数x0,x1,x2,…,xn；第三步为按照同位素丰度的定义式(如式2)，代之以质谱解卷积结果，计算得到待测物的同位素丰度，即重原子标记率。

3.1.2计算方法简化的数学推理

E=(a0A0+a1A1+a2A2+a3A3+

a4A4+a5A5+a6A6)/(c0A0+c1A1+

c2A2+c3A3+c4A4+c5A5+c6A6)×100%

由上述过程可见，本研究中的计算方法将“质量簇”法中原本对于每一个结果计算都需要解一个线性方程组的复杂流程转化为一个共性的线性代数问题，从而将“质量簇”法的三个步骤简化为一个线性计算式，降低了计算的难度，加快了计算速度。

3.2 质谱数据的选取

图1a、1b分别为液相色谱及蠕动泵引入0.1 g/L敌百虫-D6样品时所采集到的离子流图。当采用液相色谱引入样品时(图1b)，保留时间为1.57 min，峰起止时间为1.30 min～2.26 min，在此期间合计采集质谱图112张。图2a、2b、2c、2d、2e分别展示了t=1.37 min、t=1.47 min、t=1.57 min、t=1.67 min、t=2.17 min所对应的质谱图。由图2可见，这些质谱图差异较大，且越靠近色谱峰的中心(保留时间)，质谱图中m/z=257～262的相对强度越低；反之，越靠近色谱峰的边缘(峰起止时间)，这些质谱峰的相对强度急剧增高。相比之下，当用蠕动泵引入样品时(图1a)，由于样品的持续引入，所得到的离子流相对稳定，不同时间对应的质谱图之间差异不大(数据未展示)。

根据3.1讨论的结果及式(3)可知，同位素丰度的测量结果由m/z=257～263质谱峰的相对峰强度直接决定，准确测量其值才能减小丰度结果的测量误差。推测，m/z=257～263的质谱峰强度未必全部由待测物敌百虫贡献，溶剂等背景也有可能干扰测定(从而引入一部分误差)。对于蠕动泵引入样品的测定方法而言，这种背景维持在一个较稳定且较低的水平(图2f)。而由于液相色谱的分离能力，色谱峰上每一个时间点待测物浓度都不同，受背景基质效应干扰的程度也不同(图2a～2e)——数据点的采集时间越接近待测物保留时间，待测物浓度越高，受基质效应的影响也越小，从而表现出在m/z=257～262处较低的质谱相对峰强度；反之，越接近峰的边缘，待测物浓度越低，受基质效应影响则越严重，从而变现出m/z=257～262处质谱相对峰强度明显高于图2f。由此可见，如何在液质联用离子流图上选取质谱数据并进行平均，以使测定结果尽可能小地偏离蠕动泵法是方法替代的关键。

a——蠕动泵进样；b——液相色谱进样图1 敌百虫-D6离子流图a——introduced by syringe pump;b——introduced by HPLCFig.1 TICs of Trichlorfon-D6

a——液相色谱进样1.37 min质谱图；b——液相色谱进样1.47 min质谱图；c——液相色谱进样1.57 min质谱图；d——液相色谱进样1.67 min质谱图；e——液相色谱进样2.17 min质谱图；f——蠕动泵进样平均质谱图图2 不同采集方法(时间)所获得的敌百虫-D6质谱图a——mass spectrum at 1.37 min by LC；b——mass spectrum at 1.47 min by LC；c——mass spectrum at 1.57 min by LC；d——mass spectrum at 1.67 min by LC；e——mass spectrum at 2.17 min by LC；f——mass spectrum by acquired by syringe pumpFig.2 Mass Spectrums of Trichlorfon-D6 acquired by different method or at different time

根据上述推测，在选用质谱数据点时，应优先选用接近保留时间的数据点，而尽可能避免将靠近峰边缘的数据点平均到结果中，以免引起较大误差。图3展示了同位素丰度结果与质谱数据选用点数的关系——当以保留时间为中心向左右均匀地增加所选质谱数据点的数量时，平均质谱图所计算得到的同位素丰度结果随之降低；当选用的点数达到19点时，测定结果与蠕动泵法得到的结果持平(98.75 atom%D)；当超过25点时，利用平均质谱图所计算得到的丰度结果快速降低。因此，本文在用液相色谱替代蠕动泵引入样品时，选择以待测物保留时间为中心前后19张质谱图进行叠加平均，并进行结果计算。

3.3 同位素丰度测定与样品浓度的关系

采用液质联用法测定0.001 g/L，0.01 g/L，0.1 g/L，1 g/L敌百虫-D6同位素丰度的结果，每个样品平行测定6次(表1)；采用蠕动泵引入相同的样品，测定同位素丰度，每个样品平行测定6次，每两次间均采用甲醇清洗进样针6次并用500 μL甲醇清洗进样管路2次(表2)。结果表明，液质联用法在方法精密度上有良好的表现，且在样品浓度较高的时候(0.1 g/L及以上)时，测定结果与采用标准方法(蠕动泵引入样品)得到的测定结果吻合得较好。

图3 同位素丰度测定结果与质谱图选取点数的关系Fig.3 The relationship between isotope enrichment and the number of average mass spectrums

而无论哪一种方法，随着浓度降低，同位素丰度测定结果都会随之下降；尤其是当低于某一浓度时，测定结果将严重失真。这一现象印证了3.2中的推断，即当样品浓度降低时，m/z=257～262处质谱相对峰强的测定更易受到基质效应的影响，导致背景对这部分峰强度的贡献增大，从而使同位素丰度的测定结果快速下降。因此，在测定同位素丰度时，至少应保证样品溶液浓度，以免受到质谱背景的干扰。

表1 液质联用法测定不同浓度敌百虫-D6样品同位素丰度的结果Table 1 Results of trichlorfon-D6 isotope enrichment in different concentrations determined by LC-MS method

表2 蠕动泵法测定不同浓度敌百虫-D6样品同位素丰度的结果Table 2 Results of trichlorfon-D6 isotope enrichment in different concentrations determined by syringe pump method

4 小结

通过数学推算，将“质量簇”法中解线性方程组的过程简化为一个直接计算式，可大幅减少敌百虫-D6生产质控过程中结果计算所需的时间；采用液相色谱代替质谱的蠕动泵引入样品以加快样品分析的速度，通过试验及数据分析确定了质谱数据的选取范围，保持了分析结果的准确性；本文首次就样品浓度对同位素丰度测定结果的影响开展研究，明确了过低的样品浓度不利于得到准确的分析结果。目前，采用有机质谱对同位素标记试剂进行同位素丰度测定的方法尚有较大研究空间，关于如何准确、精密地测定同位素丰度的研究以及相关技术标准的制定还需要积累大量数据，本文提出的敌百虫-D6同位素丰度的快速测定和计算方法也可以推广至其他同位素标记试剂丰度的测定。