气相色谱-质谱联用法检测13C标记葡萄糖的同位素丰度

陈燕秋，侯 捷，雷 雯，李良君，徐仲杰，高慧敏

(上海化工研究院有限公司 国家同位素工程技术研究中心上海分中心上海稳定性同位素工程技术研究中心，上海 200062)

稳定同位素13C标记的葡萄糖作为安全、方便、有效的示踪工具，被广泛应用于代谢研究[1-4]、疾病诊断[5-7]、分析检测[8-9]以及有机合成[10-12]中。代谢组学是目前关注度颇高的组学方向。在代谢组学[13-16]中，13C葡萄糖作为最常用示踪剂，通过将其引入生物体或细胞内，测定不同部位或不同时间内代谢产物的含量以及对比13C葡萄糖产物的同位素丰度变化情况，以此研究特定代谢循环中目标化合物的代谢规律。Gay[17]等通过给健康女性进食不同13C丰度的食物若干天，以13C标记的葡萄糖的检测结果进行研究肝糖原的代谢动力学以及糖原新生；临床上采用13C标记的葡萄糖通过呼气试验[18]对糖尿病患者进行诊断；Riddell[19]通过青少年对摄入13C标记葡萄糖的体内代谢追踪结果，以此研究青少年锻炼期间内食物的代谢通路；杨子昂[20]采用分别给高代谢脓毒症新西兰兔和对照新西兰兔注射13C标记的葡萄糖，成功建立了高代谢脓毒症兔模型。在13C葡萄糖示踪代谢实验中，13C葡萄糖的同位素丰度是衡量示踪剂的关键指标，同时，精确检测代谢物的同位素丰度, 是进行代谢流分析的前提条件。目前，对于13C葡萄糖的同位素丰度检测方法鲜有报道。本文对比了MSTFA和MBTFA两种衍生化试剂对葡萄糖的衍生化效果，着重研究葡萄糖的酰化条件，并对辅助溶剂、衍生温度以及衍生时间等影响衍生化效果的条件进行了优化；采用选择离子检测模式(SIM)对质谱数据进行采集，建立气相色谱-质谱联用技术测定13C标记葡萄糖同位素丰度的方法，并对该方法进行验证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS/MS)：7890B-7000C，美国Agilent公司；HP-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)：美国Agilent公司；电子天平：瑞士梅特勒-托利多集团，精度0.01 mg；真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；超纯水系统：美国Merck Millipore公司。

衍生化试剂：N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)、N-甲基二(三氟乙酰胺)(MBTFA)：美国Regis Technologies公司；天然丰度的葡萄糖标准品：CNW公司，纯度99%；13C标记的葡萄糖：CIL公司，99 atom%13C；甲醇：HPLC级，Scharlab公司；吡啶：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；乙酸乙酯、甲苯、乙腈：分析纯，CNW公司。

1.2 实验方法

1.2.1葡萄糖标准溶液的配制 分别用1/100 000电子天平准确称取10 mg的天然丰度葡萄糖标准品以及13C标记葡萄糖，加5 mL超纯水完全溶解后定容于100 mL容量瓶中，混匀配制成浓度为0.1 g/L的标准储存液。将标准储存液稀释成10 mg/L，进一步稀释成0.1 mg/L的标准溶液备用。

1.2.2葡萄糖酰化反应-辅助有机溶剂的优化 选择酰化衍生反应中4种最常用的辅助溶剂进行葡萄糖衍生的优化，取4份50 μL 10 mg/L的标准溶液于30 ℃真空干燥2 h，分别加入50 μL的辅助溶剂甲苯、乙腈、吡啶和乙酸乙酯，再加入50 μL的MBTFA于70 ℃下反应1 h，待GC-MS分析。

1.2.3葡萄糖酰化反应-衍生化温度及时间的优化 各取12份50 μL 10 mg/L的标准溶液于30 ℃真空干燥2 h，依次加入50 μL的乙酸乙酯和50 μL的MBTFA，分别在60 ℃、70 ℃和80 ℃的温度下，反应30、60、90、120 min，待GC-MS分析。

1.2.4葡萄糖的两种不同衍生化产物的对比 各取50 μL 10 mg/L的标准溶液于30 ℃真空干燥2 h。1) 硅烷化反应[21]。采用N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)衍生，依次加入50 μL的吡啶和50 μL的MSTFA，80 ℃下反应1 h，待GC-MS分析；2) 酰化反应。采用N-甲基二(三氟乙酰胺)(MBTFA)衍生，依次加入50 μL的乙酸乙酯和50 μL的MBTFA，70 ℃下反应1 h，待GC-MS分析。1.2.2、1.2.3和1.2.4均利用全扫描模式(Scan)对产物进行检测，以衍生后产物的峰面积作为衡量衍生化效果的指标。

1.2.5采集模式的选择 分别取50 μL不同浓度0.1 mg/L、10 mg/L以及0.1 g/L的13C标记的葡萄糖溶液，于30℃真空干燥2 h，依次加入50 μL的乙酸乙酯和50 μL的MBTFA，70 ℃反应1 h，在全扫描模式和离子扫描模式下连续8次进样。

1.2.6实验条件 1) 色谱条件。色谱柱：Agilent HP-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气He气(纯度99.999%)，流速1.0 mL/min；进样口温度280 ℃；2) 升温程序。以5 ℃/min由80 ℃升至110 ℃，然后以10 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至170 ℃，最后以10 ℃/min升至250 ℃；进样量1 μL；不分流。3) 质谱分析条件。电子轰击离子源(EI)，电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；接口温度300 ℃。全扫描模式(Scan)：电离能量70 eV，扫描范围m/z540～560；根据全扫描的质谱图确定离子扫描模式(SIM)的质谱条件：电离能量70 eV，扫描离子m/z547、m/z548、m/z549、m/z550、m/z551、m/z552以及m/z553。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖酰化条件优化

用于糖类化合物的衍生化试剂，通常采用酰化试剂和硅烷化试剂。葡萄糖经过硅烷化或者酰化反应后，可降低葡萄糖的沸点，使其具有更好的挥发性和热稳定性。葡萄糖经硅烷化试剂衍生后葡萄糖分子中的活泼氢被三甲基硅烷(TMS)所取代(详见图1)；葡萄糖经酰化试剂衍生后葡萄糖分子中的活泼氢被酰基所取代，反应示于图2。

样品衍生化过程中，辅助溶剂的选择、衍生化时间的控制、以及衍生化温度的确定至关重要。采用硅烷化衍生的文献报道较多，参考文献[21]对葡萄糖进行硅烷衍生化，本文将着重优化葡萄糖酰化条件。

2.1.1辅助有机溶剂优化 辅助有机溶剂对衍生化效果有一定影响，葡萄糖中的某些结构会与辅助溶剂进行配合，从而影响衍生化反应的速率。以MBTFA为衍生化试剂，四种有机溶剂甲苯、乙腈、吡啶和乙酸乙酯分别作为衍生化反应时的辅助溶剂，来探究在衍生的酰化过程中辅助溶剂对13C葡萄糖的衍生化效果的影响，GC-MS分析结果示于图3。为了直观比较辅助溶剂对衍生化效果的影响，以辅助溶剂的种类为横坐标，GC-MS峰面积为纵坐标作图，峰面积大即表明该辅助溶剂的效果好。结果表明，当利用MBTFA对葡萄糖进行酰基化衍生时，乙酸乙酯作为辅助溶剂时的衍生化效果最好。

图1 葡萄糖与MSTFA的衍生反应Fig.1 Derivative reaction of glucose with MSTFA

图2 葡萄糖与MBTFA的衍生反应Fig.2 Derivative reaction of glucose with MBTFA

图3 不同辅助溶剂对目标葡萄糖衍生化效果的影响Fig.3 Effects of different auxiliary solvents on the target glucose derivatization efficiency

2.1.2衍生化温度及时间的优化 在优化衍生温度以及衍生时间时，采用乙酸乙酯作为衍生过程中的辅助溶剂。1.2.3实验中，分别考查了在60、70、80 ℃条件下，对比葡萄糖分别衍生30、60、90、120 min时的衍生效果，以此确定最优的衍生化温度及衍生时间，结果示于图4。结果表明，随着温度的升高，衍生化速度越快。但在80 ℃时，乙酸乙酯挥发严重且与70 ℃下衍生效果相差不大。因此，确定衍生化温度为70 ℃，衍生时间为60 min。

2.2 两种衍生化产物的色谱行为比较

分别采用MSTFA和MBTFA对相同浓度的13C标记葡萄糖进行衍生，总离子流图示于图5。

图4 衍生温度及时间对目标葡萄糖衍生化效果的影响Fig.4 Effect of derivatization temperature and time on target glucose derivatization efficiency

对两种不同衍生化试剂的实验组1.2.4分别设置六组相同浓度的平行实验。比较图5a、图5b及表1的峰面积数据可知，三氟乙酰化产物响应要高于硅烷化产物，且衍生产物更为稳定。因此，以MBTFA作为衍生化试剂衍生效果更好。

2.3 葡萄糖-13C6同位素丰度检测模式优化

全扫描模式(Scan)时质谱最常用的扫描方式，由于Scan模式可以采集到化合物的完整的碎片信息，在化合物定性方面具有较大优势。采用全扫描模式检测时，得到离子总量多，基线噪声大。离子扫描模式(SIM)可以较好地消除杂质干扰，检测灵敏度比全扫描模式提高了数倍。根据全扫描的质谱图确定离子扫描模式的质谱条件：电离能量70 eV，扫描离子m/z547、m/z548、m/z549、m/z550、m/z551、m/z552以及m/z553。

本实验用两种不同的采集模式探究其对检测结果的影响。采用MBTFA衍生化试剂，在2.1节优化的条件下，分别对13C葡萄糖和天然葡萄糖进行衍生。根据1.2.5实验条件，并采用文献[22]中的“质量簇”方法进行同位素丰度计算，结果列于表2。结果表明，较高浓度时(大于10 mg/L)，两种采集模式的检测结果较为接近，且两种采集模式的下方法精密度均小于0.4%，相对偏差小于0.4%；在浓度较低时(0.1 mg/L)，两种采集模式的检测结果差异较为明显。

图5 13C标记葡萄糖MSTFA衍生物(a)与MBTFA衍生化物(b)的TIC图谱Fig.5 TIC map of 13C-labeled glucose derivatized with MSTFA (a) 13C-labeled glucose derivatized with MBTFA (b)

表1 MSTFA和MBTFA衍生化后13C标记葡萄糖检测结果的峰面积Table 1 Peak area of 13C-labeled glucose detection results after derivatization with MSTFA and MBTFA

当13C标记葡萄糖处于低浓度水平时，两种采集模式检测结果偏差较大，检测结果偏差接近1%。这是由于四极杆质谱分辨率有限，导致全扫描模式(Scan)在低浓度下，无法完全分离开，如图6所示。离子扫描模式(SIM)对于含量低的物质，检出限、灵敏度均比全扫描模式(Scan)高出2～3个数量级。在检测过程中灵敏的高低直接影响同位素丰度测定的结果。化合物浓度低时，Scan模式由于基线提高导致目标物的信噪比明显降低，而SIM模式下只对包含标记位点特征离子碎片的同位素峰进行扫描，可以显著降低背景干扰，提高检测灵敏度及选择性。此外，质谱测到的同位素分布并非一个确定值，而是随着保留时间和总离子流强度而变化的，在峰的前沿、峰的中部和峰的拖尾处，得到的同位素分布不同，因此采用Scan模式进行同位素丰度检测时，会造成较大的偏差。此外，理论上样品的浓度并不影响化合物的同位素丰度，但在仪器背景的干扰下，会导致在低浓度时同位素丰度检测结果与理论值相差较大。为确保检测结果的准确性，本文所建立的酰化试剂衍生葡萄糖同位素丰度检测方法的检出限为0.1 mg/L，在此浓度下，方法相对标准偏差小于0.4%。

表2 两种采集模式对不同浓度13C标记葡萄糖丰度结果的影响Table 2 The effect of two collection modes at different concentrations on 13C-labeled glucose abundance results

图6 天然丰度葡萄糖(a)和13C标记葡萄糖(b)EI轮廓图Fig.6 Electron impact (El) profile of natural abundance glucose (a) and high abundance 13C labeling glucose (b)

3 小结

本文优化了衍生过程中辅助有机溶剂的类型以及衍生化的温度和时间，并通过不同衍生化试剂的选择，建立了基于气相色谱-质谱联用技术测定13C标记葡萄糖的丰度的方法。利用“质量簇”计算相关的质谱数据，建立的13C标记葡萄糖检测方法的计算值与理论值基本相符，方法精密度优于0.2%，绝对偏差小于0.3%。随着代谢流的不断发展，13C标记葡萄糖作为重要示踪工具，其丰度准确检测至关重要。该方法可提供13C标记葡萄糖同位素丰度检测方法，对同位素标记试剂的检测具有重要意义，为13C标记葡萄糖示踪剂的质量控制提供技术支持。