稳定同位素技术在牛奶及奶制品溯源应用中的研究进展

赵姗姗，谢立娜，郄梦洁，赵 燕

(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081)

牛奶因含有丰富的营养物质[1-2]，广受消费者欢迎，2018年，我国牛奶产量和乳品加工企业均排在亚洲前列，乳品进出口总额突破100亿美元。2019年全国乳制品销量更加大幅增长，成为全球最大的乳品新兴市场[3-4]。随着食品跨国界和跨地区流通越来越频繁、牧草资源和饲料价格上涨，市场上出现奶制品良莠不齐的现象，甚至复原乳冒充鲜奶的情况。类似“三聚氰胺”事件时有发生。为此，我国在出台的《中华人民共和国食品安全法实施条例》中规定建立健全了食品安全管理制度，通过逐步推动实行有效的追溯体系，对市场上销售的不符合质量安全标准的食品、农产品进行追本溯源，完善了惩罚性赔偿制度[5]。食品产地溯源技术的研究有利于实施食品的原产地产品保护，特色食品保护；在食品安全事件发生时，有利于快速追溯污染源头，实施有效召回，减少经济损失，保护消费者身体健康，实现“从农田到餐桌”的全程关注[6]。

目前应用于食品产地溯源研究技术有稳定同位素技术[7]、多元素分析技术[8]、红外光谱技术[9]、核磁共振技术[10]等。稳定同位素技术具有精确度高、灵敏度好、无污染等特性，近年来在食品产地溯源及真实性鉴别等方面得到了长足发展和广泛应用[11]。本文主要阐述了稳定同位素技术在牛奶及奶制品可追溯性的国内外研究进展，及对未来乳品产地溯源应用的展望，以推动稳定同位素技术在牛奶及奶制品溯源研究工作的不断深入和完善。

1 稳定同位素技术的基本原理

同位素分馏效应是指由于元素质量数的不同，在物理、化学及生物化学作用过程中，生物体内稳定同位素以不同比值分配到两种或两种以上不同的物质或同一物质两个相态的作用[11]。生物体因环境、气候、土壤、生物代谢的影响利用从而发生同位素的自然分馏效应，导致自然物质中元素的同位素丰度呈现出显著变化，从而使“重”、“轻”同位素比值发生变化，使得不同地理来源的生物体中稳定同位素[12]比值存在较大差异，进而反映出生物体所处的环境[13]。目前食品产地鉴别的研究中广泛应用的稳定同位素主要为碳、氮、氢、氧、硫。

1.1 碳同位素

根据植物固定CO2的方式可分为C3、C4和CAM植物。C3植物经光合作用的三羧酸循环产生，初始产物是3-磷酸甘油酯(三碳化合物)，如水稻、小麦等。C4植物以草酰乙酸(四碳化合物)为起始产物，由二羧酸循环产生，如甘蔗、玉米等。CAM植物是具景天酸代谢途径的植物，多为多浆液植物，如仙人球。在自然界中，碳稳定同位素有两种，即12C、13C，12C丰度为98.89%，13C丰度为1.11%。C3植物中δ13C值变化在-34‰～-22‰之间，C4植物中δ13C值的变化在-19‰～-9‰之间，CAM植物中δ13C值变化范围相比较宽，在-38‰～-13‰之间[14]。植物源性食品中所含碳同位素与光合作用中二氧化碳代谢途径有关，因此，通过测定动物体内碳同位素丰度比(13C/12C)，即δ13C值，可以准确判断动物摄入的饲料是C3植物还是C4植物，除此之外，植物源性食品中所含碳同位素还受外界环境因素的影响。研究表明，影响植物中碳稳定同位素组成的环境因素有温度、降水、光照、压力及大气中CO2的碳同位素组成等，它是生物因子与环境因子共同作用的结果[14-15]，能直接反映出植物生长的地理环境。动物源性食品的碳同位素组成与动物食用的饲料息息相关，进而可以推测动物体的膳食中C3与C4植物所占比例[16-18]。

1.2 氮同位素

氮在自然界中存在14N和15N两种稳定同位素，14N丰度为99.635%，15N丰度为0.365%，氮同位素丰度比(15N/14N)的差值表示为δ15N。不同来源的含氮物质中具有不同的氮同位素丰度。植物中δ15N值取决于土壤中的氮池(硝酸盐和氨)，而土壤中δ15N值又取决于地理和气候条件，并与农业施肥有关[19]。动物源性食品中氮同位素比值与动物的食物源和新陈代谢有关，除此之外还与土壤中化学肥料的使用，及饲料中动物源性成分有关[20]。

1.3 氢、氧同位素

自然界中的氢有1H(氕，H)、2H(氘，D)、3H(氚，T)三种同位素，其中1H、2H为稳定同位素，1H丰度为99.985%，2H丰度为0.015%，氢同位素丰度比(2H/1H)的差值表示为δ2H。氧在自然界中存在16O、17O、18O三种稳定同位素，16O丰度为99.759%，18O丰度为0.204%，通常用δ18O表示氧同位素丰度比(18O/16O)的差值。氢、氧元素构成水分子，与水循环的示踪密切相关。氧稳定同位素的分馏作用主要是由于水的蒸发、浓缩和沉淀。一般而言，自然界中的氢、氧稳定同位素具有纬度效应、陆地效应、季节效应等，即随着纬度的增加同位素比值减小；由海岸向内陆同位素比值减小；温度高的夏季重同位素更为富集[21]。同位素的分馏信息可通过奶牛饮食传递到牛奶中。动物样品中δ2H和δ18O值主要与动物饮用水及距海远近相关，是反映地理环境的良好指标[22-23]。此外氢稳定同位素还与温度、海拔高度和水同位素有关[24-25]。奶牛的品种也会对牛奶中δ18O值有一定影响，但其影响远小于膳食和地域因素[26]。

1.4 硫同位素

硫元素在自然界存在32S和34S两种稳定同位素，32S丰度为95.02%，34S丰度为4.21%，通常用δ34S表示硫同位素丰度比(34S/32S)的差值。硫元素在地质研究中较为广泛，常用来探索地质构造及环境演化，同时它也是酸雨污染研究中的一项重要指标。土壤中硫稳定同位素组成与土壤地质、降水、农业施肥等因素有关，因而动植物体中硫稳定同位素组成与其产地来源密切相关，它能有效地表征地域来源[27-28]。

2 稳定同位素技术在牛奶及奶制品中的应用

对于不同的乳产品，同位素组成有一定差异[29]。由于受到奶牛的饲喂体系、新陈代谢、原产地的土壤地质、环境等因素的影响，牛奶及其制品中稳定同位素组成会呈现出差异，因此稳定同位素组成可以反映乳品原产地的地理环境信息。目前，许多学者对于牛奶及奶制品的产地溯源研究都有了深入的探索。作为一种有效的溯源手段，稳定同位素技术在液态奶、奶粉、奶酪、黄油等方面都有良好的应用。

2.1 液态奶

稳定同位素技术在液态奶中的研究主要集中在牛奶来源的追溯、有机牛奶等高价值牛奶的鉴别等方面。1997年，稳定同位素技术首次用于研究牛奶的地理来源[19]。到目前为止，对牛奶来源的研究已经包括许多国家。2007年，Crittenden等[30]从澳大利亚和新西兰的七个乳业地区采集了牛奶样本，并对其δ13C、δ15N、δ18O、δ34S、δ87Sr值进行了分析，每个牛奶样本都显示了不同的同位素指纹。尤其是δ18O和δ13C值，符合各地区纬度和气候的同位素分馏模式，可见，稳定同位素技术在确定澳大拉西亚产奶制品的地理来源方面具有很好的潜力。Luo等[31]采集了大洋洲、美洲、欧洲和亚洲大陆牛奶样品，分析了蛋白质中δ13C和δ15N值以及牛乳水中δ2H和δ18O值，发现用δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值可以对这些地区的牛奶产地进行鉴别。稳定同位素不仅可以追溯不同国家间的牛奶来源，也可以追溯同一国家不同地区的牛奶来源。Chesson等[32]检测了美国不同地区的牛奶、市售牛奶、奶牛饮用水、自来水中δ2H和δ18O值，结果表明，产地的自来水解释牛奶中δ2H和δ18O值不足以表征奶源产地，而牛奶和奶牛饮用水中δ2H和δ18O值呈正相关关系，可以用于牛奶产地来源研究。Chung等[33]对韩国有机牛奶中δ13C、δ15N、δ18O和δ34S值进行了测定，并建立了判别模型，该模型在保宁、高昌和济州地区显示出良好的预测性，发现δ13C值是最重要的影响因素。Garbaras等[34]在夏季和冬季，在白俄罗斯的布雷斯特、戈梅尔、格罗德诺、明斯克和莫吉列夫地区采集了牛奶、水和饲料，测定了牛奶中δ18O值、乳酪蛋白中蛋氨酸δ34S值和特定乳组分中δ13C和δ15N值，其中牛奶中δ18O值在不同地区发生了变化，而δ13C值在夏季和冬季不同。中国对稳定同位素技术溯源不同产地的牛奶也有报道。明荔莉等[35]通过元素分析-稳定同位素质谱仪(EA-IRMS)建立了牛奶中碳稳定同位素检测方法，该方法的稳定性和准确性均达到了同位素比值测定的要求，结果表明，不同产地、不同品牌的牛奶中δ13C值差异显著。此外，稳定同位素技术在罗马尼亚[36]、马来西亚[37]及阿根廷[38]不同地区的牛奶溯源中也起到了重要的作用。

牛奶中的稳定同位素组成与饮食有着重要的相关性。δ13C值相对低的牛奶来自以草地为主的地区，而δ13C值相对较高的牛奶来自以农作物种植为主的地区。Konbbe等[39]对6个月不同饲养条件下牛奶样品中碳、氮稳定同位素组成进行了分析，牛奶中δ13C值取决于基于C3或C4植物的不同喂养方式，草饲条件下牛奶中δ13C值比玉米饲喂条件下的牛奶中δ13C值低，两种喂食方式下，牛奶中δ15N值差异小于δ13C值，因为δ15N值通常反映了不同地区不同农业条件(如不同的肥料)[19, 40]。Camin等[41]以2个农场的奶牛为研究对象，以不同种类的C3植物和不同数量的玉米为饲料，研究了饲料和牛奶的稳定同位素比值(δ13C、δ15N、δ18O、δ2H)，结果表明，乳酪蛋白和脂类中δ13C与玉米在动物日粮中的比例显著相关，但是牛奶中δ18O值和酪蛋白中δ18O、δ2H值和δ15N值不仅受饲料中玉米含量的轻微影响，还与产地的地理气候和土壤特征以及日粮中新鲜植物或青贮饲料的存在有更密切的关系。由于饲料组成对牛奶中碳稳定同位素比值具有重要影响，因此稳定同位素技术是鉴别有机牛奶等高价值牛奶的有效手段。Molkentin等[42]通过对碳稳定同位素比值的分析，可以完全区分有机奶和常规奶。对于传统饲养得到的牛奶，其脂肪的δ13C值为-26.6‰或者更高，而有机奶奶脂肪中δ13C值低于-28.0‰，这是由于传统农场的基本饲料由60%的玉米青贮组成，有机农场在放牧期间只使用少量的玉米青贮，而使用较高比例的草(C3植物)[43]。稳定同位素技术也可以用于生鲜乳和复原乳的鉴别。Lin等[44]从不同季节的奶牛场采集牛奶和地下水样品，测定了δ2H和δ18O值，研究了稳定同位素比值质谱法鉴别生乳和复原乳的可能性，结果表明，用地下水配制的复原牛奶和生鲜牛奶之间存在差异。

2.2 奶粉

奶粉是由鲜奶消毒后经浓缩、喷雾、干燥而成的。鲜奶加工成奶粉后，水分降低，蛋白质、无机盐、脂肪等营养素占比增加。奶粉是全球最常见的牛奶交易形式，国际贸易中奶粉常被用作其他产品(如婴儿配方奶粉、糖果)的成分，有必要建立一个溯源体系，提供有关该混合物乳制品成分来源的信息。随着“三聚氰胺”事件的发生，近年来，我国研究人员对奶粉的研究也逐渐增多，对奶粉的稳定同位素研究大多集中于奶粉中碳、氮稳定同位素。李鑫等[45]利用元素分析仪-稳定同位素质谱仪建立了原料乳粉中δ13C和δ15N值的检测方法，显示出良好的稳定性和重现性。δ13C值能直观的反映出原料乳粉地域和奶牛喂养方式的不同，可以作为原料乳粉产地来源的指示参数，而原料奶粉中δ15N值的测定可以在健全产地数据库后起到初筛异常牛初乳的作用。不仅奶粉中的稳定同位素比值可以提供奶粉的产地信息，酪蛋白和脂肪酸中的稳定同位素比值也是重要的溯源标志指标。梁莉莉等[46]通过EA-IRMS技术测定了不同阶段的婴幼儿配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值，研究发现δ15N和δ13C值与奶粉原产地具有相关性，且同一地区的婴幼儿配方奶粉中酪蛋白的碳、氮稳定同位素分布呈正相关，而在不同地区则存在显著差异。苏静[47]以不同产地及适应不同人群的15种奶粉为研究对象，测定分析了脂肪酸的碳、氢稳定同位素比值，结果表明奶粉脂肪酸中δ13C值差异在奶源的地域性上得到反映，长链脂肪酸中δ2H值也与地域特征有明显关系；随着碳链的延长，其13C同位素在贫化，2H同位素在富集，两种同位素变化趋势正好相反。相比之下，国外利用稳定同位素技术对奶粉的研究较少。Ehtesham等[48]研究了新西兰各地的散装奶粉和奶粉脂肪酸中δ13C和δ2H值与其产地的相关性，发现4种脂肪酸(C4∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶1)和散装奶粉中δ13C和δ2H值与产地有关，且采用脂肪酸δ13C和δ2H的线性判别分析(LDA)模型提供了最佳的分离效果。因此，脂肪酸的同位素组成可以作为奶粉中一个很好的标志指标，通过传递可靠的同位素信息来追踪奶粉的区域来源。

2.3 奶酪

稳定同位素比值也常作为奶酪产地溯源的关键参数。Camin等[49]对来自法国、意大利和西班牙三个国家奶酪中C、N、H、O、S稳定同位素比值进行了分析，发现酪蛋白和甘油中δ13C与奶牛饲料中玉米的含量呈正相关，甘油中δ18O值还与季节、温度、湿度等因素有关，利用稳定同位素比值对奶酪原产地进行判别分析，判别正确率高达90%以上。Pillonel等[50]通过采集瑞士和法国的拉克雷特奶酪，证明了δ2H、δ13C、δ15N和δ34S值作为区分拉克雷特奶酪原产地指示物的潜力，根据主成分分析图显示，这四种稳定同位素比值很好地表征了三个区域，即瑞士、法国西北和法国中东地区。除了对不同国家奶酪样品的鉴别，利用稳定同位素比值分析对邻近地理区域奶酪的可追溯性也有报道。Valenti等[51]研究表明碳、氢、氧、氮和硫稳定同位素比值的变化可以区分受保护原产地(PDO)区域内附近地区生产的奶酪；其中硫和氮稳定同位素比值提供了最好的鉴别效果(97.2%的奶酪正确分类)。利用碳氮稳定同位素比值以及脂肪中的氧稳定同位素比值还可以区分来自意大利不同地区的牛羊奶酪[52]。

稳定同位素组成对来自不同地形特点的山区奶酪也有较好的区分效果。Bontempo等[53]研究了两种典型的山地奶酪中H、C、N、O稳定同位素比值，结果表明这些稳定同位素组成与产地的植被类型、地理条件、海拔高度有密切关系，其中δ15N值与植被类型的关系更为密切，δ18O和δ2H值则与海拔高度更具有相关性。利用稳定同位素比值，可以在两个山区的两种不同类型的牧场中获得样品之间较好的区分度。相比于其他稳定同位素，碳稳定同位素更能表现出奶酪样品的地域差异。Altieri等[54]根据碳、氮、氧稳定同位素分析了马苏里拉奶酪的产地，实验表明，牛奶和奶酪中δ13C、δ15N值没有明显差异，表明碳和氮稳定同位素在奶酪生产过程中未发生分馏效应；δ13C值受饮食的影响，能反映出不同地域的信息，δ15N值由于会受到反刍动物新陈代谢分级调节的影响，不能准确的显示地域差异。

2.4 黄油

利用H、C、N、O、S和Sr的稳定同位素建立真实样本数据库来确定盲样地理来源，可以在实际案例中获得准确的结果；在不同基质样本中测量稳定同位素比值，不同实验室之间进行比较，共同构建完善的样本数据库，已经成功应用到奶酪及黄油的产地溯源[55]。Rossmann等[56]采集了欧盟的不同国家及欧盟以外国家的黄油样品，测定了黄油中δ13C，黄油蛋白中δ13C、δ15N、δ34S和δ87Sr，以及黄油水中δ18O值，结果显示稳定同位素比值可以准确地检测出黄油的区域来源，其中δ15N和δ34S值在黄油产地鉴别中起到尤为重要的作用。

3 稳定同位素技术结合其他溯源方法在奶制品中的应用

稳定同位素分析技术作为食品产地溯源研究的主要方法之一，与其他溯源技术结合能更快速有效的区分奶源产地及物种来源。

3.1 稳定同位素结合矿物元素

矿物元素是一项有效的食品产地溯源指标，主要是寻找与地域有关的特征元素。土壤、水、食物的矿物元素组成及含量都有其各自的特征图谱，动物不断的从所生活的环境中获取各种矿物元素，导致不同地域来源的乳制品中矿物元素与当地环境中的矿物元素有较强的相关性，从而具有典型的指纹特征。检测矿物元素含量的仪器有原子吸收光谱仪(AAS)、原子荧光光谱仪(AFS)和电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)等。其中ICP-MS由于检测精度高、检出限低、灵敏度高、检测速度快、可同时检测多种元素的特点，在食品产地溯源方面的应用日益增加。首次利用矿物元素研究乳制品的来源和品种是在1995年[57]，之后矿物元素分析被逐渐应用于乳制品的溯源研究[58-60]。

3.2 稳定同位素与化学成分的结合

脂肪酸是食品的固有属性，能为溯源提供有效的信息，脂肪酸的组成和含量可作为食品来源鉴别指标。奶制品中不同脂肪酸含量和比率与动物的所处环境的土壤、气候有关，同时也与饲料配比、饲养方式等因素密切相关，可以通过分析奶制品中脂肪酸的组成及含量特征对奶制品进行产地溯源研究[67-68]。Molkentin等[69-70]通过乳脂肪碳稳定同位素和脂肪酸的差异，对德国有机牛奶和常规奶进行识别，由于有机奶中α-亚麻酸(C18:3ω3)和二十碳五烯酸(C20:5ω3)含量较高，所以脂肪酸可以将有机牛奶和传统牛奶全区别开来，而且有机奶δ13C值显著低于常规奶δ13C值，研究还发现， C18:3ω3和δ13C之间有明显的负相关性(r=-0.92)。Erich等[71]测定了乳蛋白、乳脂肪中碳同位素比值及α-亚麻酸含量，并用NMR对乳脂进行了分析，多维度数据结合显著提高了德国生奶和零售奶的鉴定准确率，与单独使用IRMS相比，分类准确率提高到95%。

氨基酸也可以用来鉴别不同地区的奶制品，游离氨基酸对于奶酪的香气和口感至关重要，它们是由奶酪成熟过程中蛋白质水解现象形成的。Manca等[72]采集了撒丁岛、西西里岛和阿普利亚的羊奶干酪，测定了酪蛋白中稳定同位素比值(δ13C和δ15N)，并用高效液相色谱法测定了干酪样品中部分游离氨基酸比值(His/Pro、Ile/Pro、Met/Pro和Thr/Pro)，应用主成分分析、聚类分析及线性判别分析方法进行多元数据处理，结果表明，对变量Ile/Pro、Thr/Pro、δ13C和δ15N进行线性判别分析后，样品的判别正确率达到了100%。

4 总结与展望

4.1 问题及建议

稳定同位素技术也有一定局限性，除了饲料成分，物种、品种、动物代谢、气候、环境及采样季节都会导致乳制品中稳定同位素比值的变化，加工过程也会对乳制品同位素比值造成影响，使得小区域样本产地鉴别难度较大。因此利用稳定同位素技术溯源牛奶及奶制品，要考虑多种因素的影响。稳定同位素技术不足以对牛奶及奶制品进行产地溯源和真实性判别时，可以选择将稳定同位素技术与多种技术如矿物元素、化学成分分析等相结合，增加判别因子，从而得到更完整、更准确的判别结果，以实现牛奶及奶制品的产地精准溯源。

4.2 展望

稳定同位素技术在牛奶及奶制品产地溯源及真实性研究中具有独特的作用，对乳制品产地追溯、有机乳以及复原乳的鉴别具有潜在的市场需求，但是我国对这方面的研究较少，可能是对稳定同位素在动物体内的分馏机制了解不够深入，影响了稳定同位素技术在牛奶及奶制品产地溯源和真实性研究中的应用。未来我们可以探索饲料和饮用水中稳定同位素组成与牛奶及奶制品中稳定同位素组成的关系，研究稳定同位素比值在动物代谢中的分馏过程及影响因素，将产地、饲料、饮用水、牛奶及奶制品一一对应，加大真实样本数据库的建立。随着数据库的扩充，牛奶及奶制品产地信息的更新，溯源系统不断完善，我国乳制品行业将迎来发展新阶段。