基质分散固相萃取-同位素稀释-液相色谱-高分辨质谱法测定水产品中的100种兽药

赵善贞，盛永刚，张 旖，邓晓军，伊雄海，赵超敏，朱 坚

(上海海关，上海 200135)

虽然针对兽药残留，我国已制定相关法律法规《农业农村部第250号公告：食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》[1]、《GB 31650—2019 食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[2]，但是滥用兽药问题仍旧严峻，动物源性食品中检出国家规定不得使用的药物，或者超量使用兽药仍是目前食品中主要存在的问题之一。

目前，对于跨类别兽药同时检测的方法，农业部已出台相关的法律法规[3-4]，但是上述方法都是针对的是畜禽血液和尿液中多兽药残留的测定，对于动物源性食品中多兽药残留的同时检测，尚未制定相关法律法规。

随着国内外技术不断更新换代，在兽药多残留检测领域的研究已经取得了显著进展[5]。随着质谱的发展和推广，一次进样完成多种类残留分析已成为可能[6]。目前对于动物源食品中多种兽药同时测定的液相色谱-质谱方法，包括液相色谱-三重四极杆串联质谱法[7-12]等低分辨质谱方法，以及液相色谱-飞行时间质谱法[13-18]、液相色谱-静电场轨道阱质谱法[19-22]等高分辨质谱方法。采用三重四极杆质谱进行检测时，为了保证每个MRM通道的驻留时间，需要根据化合物的色谱保留时间分段设定参数，能够同时检测的化合物数量有一定的限制。如果要进行未知化合物的筛选，则需要全扫描模式采集数据，单位分辨的四极杆质谱在全扫描模式下的灵敏度很差，不能满足残留分析的要求。因此，兽药残留检测正从传统的液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)的定向检测，逐渐向高分辨质谱(HRMS)非定向全扫描方法转变[23]。飞行时间质谱仪的精确质量测定在复杂样品检测中有很好的选择性和灵敏度，同时也需要保证足够的质谱分辨率，否则在筛选时容易出现假阴性[24]。静电场轨道阱质谱仪具有分析速度快等特点，能够使待测物和共流出物有效分离，同改善了高分辨质谱的定量能力[25]。与飞行时间质谱相比，静电场轨道阱质谱在分析复杂基质样品时，在前处理和方法优化上效率更高，更节省时间[26]。

目前在多兽药残留检测中，多采用外标法进行定量。但是由于受到基质效应的制约，不科学的前处理方法往往会使分析结果产生较大偏差，在可获得标记目标化合物的情况下，稳定同位素稀释技术(IDMS)是消除定量过程中基质效应影响最有效的方法[27]。采用同位素稀释质谱法测定食品中的农兽药残留和非法添加剂等有害物质，可校正前处理过程的损失，降低基质效应，消除仪器响应的误差，提高定量的准确性[28]，在具有绝对测量性质的方法中，同位素稀释质谱法是唯一一种微量、痕量和超痕量元素权威测量法[29]。

综合考虑上述检测方法和定量方法上的优缺点，本方法结合基质分散固相萃取(dSPE)进行前处理，采用液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱仪进行检测，同位素稀释法进行定量测定。方法具有前处理简单，高通量、高灵敏度等特点，可为提高监管部门的工作效率，保障水产品安全提供技术保障。

1 实验方法

1.1 仪器、试剂与材料

四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪：Q Exactive美国赛默飞世尔科技，配有H-ESI Ⅱ离子源；液相色谱仪：Dionex Ultimate 3000高压液相色谱带自动进样器；电子分析天平：精度为0.000 01 g和0.01 g，德国Sartorius公司；均质器：美国Polytron公司，转速可达20 000转；涡旋震荡器：美国VORTEX公司；离心机：美国BECKMAN公司，转速可达10 000 r/min；色谱柱：Boxton C18(100 mm×2.1 μm，粒径3.5 μm)。

以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。乙腈、甲醇：色谱纯，德国CNW公司产品；甲酸：色谱纯，美国Sigma公司产品；氟化铵、乙酸铵、C18、MgSO4、 NaCl：上海安谱科技有限公司；100种兽药标准品和26种兽药内标标准品：纯度均大于98%，上海道垚测试技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1样品提取 准确称取2 g(精确至0.01 g)试样，于50 mL塑料离心管中，加入内标混标，加入1 g氯化钠，加入7.5 mL乙腈，均质5 min，涡旋混匀5 min，超声15 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液，残渣用7.5 mL乙腈重复提取一次，合并提取液，待净化。

1.2.2样品净化 在上述提取液中加入900 mg MgSO4、50 mg C18，涡旋混匀，超声15 min，4 ℃、4 000 rpm，离心5 min，取全部提取液，40 ℃水浴氮吹至近干，50%的乙腈水溶液定容至1 mL，10 000 rpm 离心5 min，取上清液，上机测定。

1.3 液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱条件

1.3.1液相色谱条件 色谱柱：Boxton C18(100 mm×2.1 μm，粒径3.5 μm)。流动相：A：0.1%甲酸，B：含0.1%甲酸的乙腈(正模式)，A：乙腈，B：0.5 mmol/L氟化铵(负模式)；梯度洗脱程序：0～5.0 min：98%A～90%A；5.0～12.5 min：90%A；12.5～18.0 min 90%A～50%A；18.0～20.0 min：50% A～20%A；20.0～22.0 min：20% A～0%A；22.0～24.0 min 0%A；24.0～25.0 min：0%A～98%A；25.0～30.0 min：98%A。流速：400 μL/min。柱温：35 ℃。进样量：10 μL。

1.3.2质谱条件 质谱扫描方式：检测器全扫描(full MS)和数据依赖扫描(ddMS2)模式；电喷雾正离子扫描(ESI+)，电喷雾负离子扫描(ESI-)。其中，正离子模式：喷雾电压2.8 kV，负离子模式：喷雾电压-2.8 kV。碰撞气、雾化器和干燥气均为氮气。透镜电压：55 V。离子源温度：350 ℃。毛细管温度：325 ℃。全扫描的分辨率R=70 000；全扫描范围m/z80～1 200；二级全扫描模式：分辨率R=17 500。

1.3.3计算结果和表述

用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中100种兽药的残留含量,计算结果需扣除空白值：

(1)

式中：X——试样中待测组分的含量，单位为μg/kg；c——标准工作液中待测组分的浓度，单位为ng/mL；csi——标准工作液中内标物的浓度，单位为ng/mL；ci——试样中内标物的浓度，单位为ng/mL；As——标准工作液中待测组分的峰面积；A——试样中待测组分的峰面积；Asi——标准工作液中内标物的峰面积；Ai——试样中内标物的峰面积；V——样品总稀释体积，单位为mL；m——试样质量，单位为g。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

本方法的化合物pKa范围跨度较大，既有呈碱性的化合物如孔雀石绿等三苯甲烷类化合物、磺胺甲噁唑等磺胺类化合物、氧氟沙星等喹诺酮类化合物，也有部分呈酸性的化合物，如己烯雌酚、己烷雌酚等二苯乙烯类化合物。方法以脂肪含量较高的三文鱼中100种兽药的回收率为依据，考查乙酸乙酯和乙腈对100种兽药的提取效率，这里采用外标法定量。由图1中典型兽药的提取效果可见，乙腈的提取效果均优于乙酸乙酯。再次方法比较了含 0.1%甲酸的乙腈和乙腈对上述化合物的提取效果，结果发现0.1%甲酸的乙腈和乙腈对上述化合物提取效率相当，但是红霉素在酸性条件下极不稳定容易分解[31]，方法最终确定以乙腈提取后进行净化。

再次，以三文鱼中100种兽药的回收率为依据，比较了C18、C8对目标化合物的吸附和净化效果。这里采用外标法定量。C18和C8都是常用的分散固相萃取吸附剂，具有良好的除脂能力，水产品的主要成分为蛋白质及脂肪，方法采用乙腈提取后，已沉淀大部分蛋白，经过C18和C8除脂后可见，对于大部分化合物，C18的回收率较C8高，因此本方法最终选择50 mg C18和900 mg MgSO4，作为净化填料。

图1 不同提取溶剂对典型化合物的提取效果Fig.1 Extraction effect of different extraction solvent for typical veterinary drugs

图2 三文鱼采用不同基质分散固相萃取粉末净化后100种兽药的回收率Fig.2 Recovery of 100 kinds of veterinary drugs cleaned up by different kinds of dSPE powder in salmon

2.2 色谱和质谱条件的优化

高效的色谱柱是多组分分析的前提条件，方法比较了Thermo Accucore RP-MS C18(100 mm×2.1 mm，粒径2.6 μm)、Thermo Hypersil C18(150 mm×4.6 mm，粒径3 μm)以及Boxton C18(100 mm×2.1 μm，粒径3.5 μm)色谱柱对100种化合物的分离情况。结果表明，氧氟沙星、诺氟沙星等喹诺酮类化合物在Thermo Accucore RP-MS C18色谱柱上脱尾严重，采用Thermo Hypersil C18(150 mm×4.6 mm，粒径3 μm)分离化合物时，隐色孔雀石绿、隐色结晶紫等化合物峰形较差，而Boxton C18(100 mm×2.1 μm，粒径3.5 μm)色谱柱对上述化合物种化合物均具有较强的保留效果，各化合物色谱峰形较好。

根据100种兽药的电离性质(见表1)，分别选用ESI+和ESI-作为离子化模式，采用流动注射泵连续进样方式进行一级质谱全扫描，选择响应最强的目标离子作为一级母离子。己烯雌酚、己烷雌酚、己二烯雌酚、雌酮、炔雌醇、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考以及4’4-二硝基均苯脲等化合物在负离子模式下响应较强，母离子为[M-H]-；其余化合物均在正离子模式下响应较强，母离子为[M+H]+。

欧盟EC 2002/657号文件对多级质谱确证时的碎片类型和所需识别点给出了明确规定，要求禁用物质的确证必须达到4个识别点。在高分辨质谱中，每个母离子的识别点规定为2.0，每一个子离子的识别点为2.5。因此，利用Orbitrap MS只需一个母离子和一个子离子即可完成对目标物质的确证。

四极杆/静电场轨道阱质谱仪的分辨率可以达到70 000，对于分子组成成分不同，但是分子量接近的化合物可以通过质谱仪进行分离。如噁喹酸和氟甲喹，两个化合物的母离子分子量十分接近，而且都会产生质荷比(m/z)为 (262.0/224.0)的碎片，采用常规的低分辨质谱仪如三重四极杆质谱仪进行检测时，必需通过色谱条件优化，进行色谱分离后，才能对化合物进行定性定量检测。 采用四极杆/静电场轨道阱质谱仪进行检测时，由于其高分辨率，精确质量准确度误差可达5 ppm，通过质谱仪即可以分离上述化合物。对于同分异构体，由于其化合结构组成一致，因此母离子精确分子量也完全一致，高分辨质谱仪也无法对其进行分离，必需通过色谱分离。

图3 100种兽药的提取离子流色谱图Fig.3 Extracted ion current chromatograms of 100 kinds of veterinary drugs

2.3 基质效应和定量方法的选择

基质效应是由基质中的共提干扰物(非目标化 合物)与目标化合物竞争电离所致[31]。本方法对100种兽药的基质抑制率进行考察。基质抑制率=样品基质中兽药的响应值/溶剂中兽药的响应值 。方法对三文鱼和虾中的基质抑制率分别进行考察，由图4可见，三文鱼和虾中基质抑制率差异不大，大部分化合物的基质效应在0.4～1.2之间。

图4 100种兽药的基质抑制率Fig.4 matrix inhibition rate of 100 kinds of veterinary drugs

由于受到基质效应的制约，不科学的前处理方法往往会使分析结果产生较大偏差，在可获得标记目标化合物的情况下，稳定同位素稀释技术是消除定量过程中基质效应影响最有效的方法。方法比较了外标法和同位素稀释内标法对定量结果的影响。结果发现，和外标法相比，采用稳定性同位素试剂作为内标，不仅能够同时准确地提供定性和定量信息，而且有效避免样品基质的影响，校正方法中出现的误差，显著提高兽药残留检测方法的稳定性。

本方法涉及的化合物种类繁多，同类化合物中不同化合物间也存在较大差异，本方法考察了三文鱼基质中，内标法和外标对定量结果准确性的影响。在每一类化合物中选择1～5种同位素内标，即保证所选内标的定量准确性，同时尽量控制内标的数量，以减少实验过程中内标配制等带来的复杂操作，同时控制所用内标标准品的成本。图5给出了典型化合物两种定量结果的比较，可见和外标法相比，大部分兽药内标法的定量结果准确性均有所提高。

图5 三文鱼中典型兽药的不同定量方法结果比较Fig.5 Comparison of result by different quantitative method of typical veterinary drugs in salmon

2.4 方法的线性关系、定量限、回收率和精密度

在本方法所确定的实验条件下，分别配制基质标准溶液进行测定，以化合物的母离子的响应峰面积比值(Y轴)对相应的质量浓度比值(X轴)作图，绘制各类药物标准曲线，各药物的线性方程相关系数R2>0.99，在空白基质中添加各药物的混合标准溶液，信噪比S/N>10作为方法的定量限，本方法中，上述化合物的定量限在0.1～10 μg/kg之间。

分别在空白基质中，添加1倍、2倍、10倍的混合标准品溶液，每个添加水平进行6次平行试验，按上述方法进行样品预处理和测定100种，每类选取代表性兽药1～4种，其平均回收率以及相对标准偏差(RSD%)见表2。

2.5 实际样品测定

采用本方法本方法在100批次水产品中进行检测，在甲鱼、南美白对虾等2个样品中发现存在恩诺沙星残留，含量在2.61 μg/kg～7.23 μg/kg之间。

表2 鱼、虾基质中30种典型兽药的回收率和RSDTable 2 Recovery and RSD of 30 kinds of typical veterinary drugs in fish and shrimp

续表2

续表2

4 结论

本方法采用基质分散固相萃取-同位素稀释-液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱方法，实现了水产品中100种兽药同时定性、定量分析的方法。方法前处理简单，重现性好，分辨率高，可满足日常工作中对水产品中100种兽药进行快速定性、定量分析。