稳定同位素D标记甜蜜素的合成

邱 婷，张曙盛,2，朱苏珍，郭寅龙

(1.中国科学院 上海有机化学研究所，上海 200032；2.上海中医药大学 创新中药研究院，上海 201203)

甜蜜素，化学名环己基氨基磺酸钠(sodium cyclamate)，是一种常用的人工合成甜味剂，于1937年被伊利诺伊大学的学生麦克尔·斯维达 (Michael Sveda) 发现。甜蜜素甜味纯正，甜度能达到蔗糖的40～50倍，是一种非营养型甜味剂。由于其价格便宜，而且用量稍多也不会有苦味[1]，因而被广泛应用于各类食品、调味品、化妆品中。从1986年我国卫生部批准甜蜜素作为食品添加剂至今，甜蜜素在我国已使用了几十年。但有研究指出甜蜜素在肠道细菌作用下能分解成有慢性毒性的环己胺[2]，可能有致癌、致畸、损害肾功能等副作用。因而包括美、英、日、韩、加拿大等在内的40多个国家相继禁止在本国使用甜蜜素作为食品添加剂。我国虽还未明文禁止使用甜蜜素，但由于其安全性一直受到质疑，在中华人民共和国卫生部发布的《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)中，就对人工甜蜜素的适用范围和使用量进行了明确限定。为了规范甜蜜素的使用，需要一种能快速、准确的技术对其进行检测。食品安全国家标准《食品中环己基氨基磺酸钠的测定》(GB 5009.97—2016)中规定了三种甜蜜素的分析检测方法，分别为气相色谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱/质谱法。其中液相色谱-质谱/质谱法因为具有灵敏度高、分离能力强等优点，近年来在食品安全检测领域的应用越来越多。但是，该方法需要克服复杂的食品样品的基质效应，样品处理过程较为繁琐。相比传统的色谱-质谱联用技术，稳定同位素内标试剂与同位素稀释质谱法结合的检测技术能在保证高灵敏度的同时，还具有抗干扰能力强、快捷高效等优点，因此有望成为一种很有前途的替代方法，不过同位素稀释质谱法需要相应的稳定同位素内标试剂配合使用[3-4]。因此稳定同位素内标试剂的合成无疑是这种检测方法是否能使用的关键。

目前报道的同位素标记甜蜜素主要为放射性标记，如用35S和14C标记的甜蜜素研究甜蜜素在生物体内的分布和代谢[5-7]，35S标记的甜蜜素用于同位素稀释法定量测定甜蜜素[8]等，而稳定同位素标记的甜蜜素则未见报道。而且，由于35S、14C具有放射性，它们的衰变过程中标记试剂的化学纯度会不可避免地随着时间的延长而越来越低。同时，目前由于放射性物质需要具有相应资质的单位和个人才能使用，因此其应用受到限制。为了解决这些问题，本研究开发了一种稳定同位素氘标记的甜蜜素，其合成方法简单成熟，原料廉价易得，得到氘代甜蜜素的氘同位素丰度大于99 %，可很好的作为内标试剂用于甜蜜素的定性、定量分析。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

IKA RCT basic IKAMAG safety control型磁力搅拌器：艾卡(广州)仪器设备有限公司； Heidolph Hei-VAP Precision型旋转蒸发仪：海道尔夫仪器设备(上海)有限公司；JULABO FL601型冷却循环器：优莱博技术(北京)有限公司；400MHz核磁共振谱仪：美国布鲁克公司(Bruker)；Thermo Scientific TSQ Fortis三重四极杆质谱仪：美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher)。

1.2 主要材料与试剂

重水(D2O)：2H同位素丰度≥99.8%，美国剑桥稳定同位素公司(Cambridge Isotope Laboratories, Inc)；环己酮、盐酸羟胺、无水乙酸钠、邻二氯苯、无水乙醚、氢氧化钠、金属钠、无水硫酸镁等试剂：均为市售分析纯或化学纯，购买后直接使用，未进一步纯化，国药集团上海化学试剂公司。

1.3 实验方法

同位素氘标记甜蜜素的合成路线示于图1，以环己酮为原料，经过H-D交换、还原胺化、磺酰化、碱中和成盐等几个关键步骤，得到2,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸钠。

1.3.12,2,6,6-四氘代环己酮肟的合成 干燥的50 mL茄形瓶中加入20 mL重水、100 mg氢氧化钠(或者50 mg金属钠)，溶解后再加入4.0 mL环己酮，装上回流冷凝管，加热至90 ℃并搅拌反应3 h进行氢-氘交换反应，冷却到室温后用无水乙醚萃取，收集有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩后得邻位氘代环己酮；将得到的邻位氘代环己酮再进行两次氢-氘交换反应，最后得到四氘代环己酮与重水的混合液；向得到的四氘代环己酮与重水的混合液中加入6.0 g盐酸羟胺、9.0 g无水乙酸钠，加热至70 ℃并搅拌反应10 min，冷却到室温后用乙醚萃取，有机相浓缩后柱层析得到2,2,6,6-四氘代环己酮肟3.5 g，收率为76%。

图1 甜蜜素-D4的合成路线Fig.1 Protocols for the synthesis of sodium cyclamate-d4

1.3.22,2,6,6-四氘代环己胺的合成 250 mL的茄形瓶中依次加入3.0 g 2,2,6,6-四氘代环己酮肟，100 mL无水乙醚，冰水浴下搅拌，缓慢分批加入5.0 g氢化铝锂，加热回流并搅拌反应，30 min后用冰水浴冷却反应体系，缓慢滴加饱和硫酸钠水溶液，使未反应的氢化铝锂刚好猝灭，无气泡产生为止，反应体系用硅藻土过滤，滤饼用乙醚洗涤，滤液用无水硫酸钠干燥，浓缩，得到2,2,6,6-四氘代环己胺2.3 g，收率为85%。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ1.05～1.31(m,3H),1.55～1.75(m,2H),2.03(s,2H),2.64(s,1H)。

1.3.32,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸钠的合成 20 mL的封管中加入1.0 g氨基磺酸、2.0 g 2,2,6,6-四氘代环己胺、4.0 mL邻二氯苯，加入一颗磁力搅拌子，密封后加热至180 ℃并搅拌回流反应4小时，冷却到室温后加入10 mL 10%的氢氧化钠溶液中和至pH值大于9，再加入10 mL石油醚，分去有机相，收集水相用活性炭脱色后，浓缩至4 mL左右，置于冰水浴中冷却结晶，过滤，得到2,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸钠1.9 g，收率为92%。高纯度样品可以使用热水重结晶。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ1.01～1.21(m,3H),1.44～1.53(m,1H),1.56～1.64(m,2H),2.84(d,1H,J=6.02 Hz),3.79(d,1H,J=6.06 Hz)。

2 结果与讨论

2.1 产物合成

稳定同位素氘标记的环己胺的同位素丰度直接决定了最终合成的氘标记甜蜜素的同位素丰度，因此本研究首先优化了氘代环己胺的合成方法。Gordon等使用氘代氢化铝锂还原环己酮肟，得到一氘代环己胺[9-10]。本研究选择环己酮还原胺化的方法合成环己胺，在碱性条件下使用重水与环己酮发生氢-氘交换反应，得到羰基邻位四氘代环己酮，再与盐酸羟胺缩合得到四氘代环己酮肟，再使用氢化铝锂还原得到四氘代环己胺。在反应过程中，使用的是同位素丰度99.8%的重水，加入氢氧化钠催化环己酮羰基的烯醇化，实现了羰基邻位的氢-氘交换。同时，为了保证得到同位素丰度足够高的氘代环己胺，连续进行了三次环己酮的氢-氘交换反应(图2)，来确保环己酮邻位氘的同位素丰度大于99%。在合成四氘代环己酮肟时，由于四氘代环己酮价格昂贵，为了保证四氘代环己酮的高转化率，本方法使用了过量盐酸羟胺。同样的，在还原四氘代环己酮肟时也使用了过量的还原剂氢化铝锂，最终以65%的总收率得到2,2,6,6-四氘代环己胺。

图2 环己酮的氢-氘交换反应Fig.2 Hydrogen-Deuterium exchange reaction of cyclohexone

环己基氨基磺酸钠(甜蜜素)的常用合成方法示于图3，一般以环己胺为原料，使用氨基磺酸、氯磺酸、三氧化硫-三甲胺复合物等不同的磺化试剂进行磺化反应[11-16]，再碱化结晶得到环己基氨基磺酸钠。综合考虑原料的易得性、腐蚀性和毒性，本研究选择氨基磺酸为磺化试剂。同时，参考杨辉荣[14]等的工作，以邻二氯苯为溶剂，环己胺和氨基磺酸的当量比为1∶2，在160 ℃下反应3 h，可以得到环己基氨基磺酸钠。经过尝试，发现适当升高温度和延长反应时间，有利于提高收率。由于环己胺的沸点为134 ℃，邻二氯苯的沸点为179 ℃，为了防止氘代环己胺逸出反应体系，选择以封管为容器进行反应，在180 ℃下进行4 h，最终以92%的收率得到氨基磺酸。

图3 甜蜜素的常见合成方法Fig.3 The common method for the synthesis of sodium cyclamate

2.2 产物表征

关键中间体2,2,6,6-四氘代环己胺的核磁谱图示于图4，δ2.64为氨基α位氢的核磁信号，δ2.03为氨基氢的核磁信号，因与水的信号重叠，积分大于2，δ1.00～1.72之间的为环己烷3,4,5位6个氢的核磁信号。

产物2,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸钠的核磁谱图示于图5，δ3.79为磺酰胺N-H的核磁信号，δ2.84为环己基1位氢的核磁信号，δ1.02～1.62之间的为环己烷3,4,5位6个氢的核磁信号。

图4 2,2,6,6-四氘代环己胺的1H NMR谱图Fig.4 1H NMR spectra of 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexylamine

图5 2,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸钠的1H NMR谱图Fig.5 1H NMR spectra of sodium 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexyl sulfamate

采用负离子模式分析产物2,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸钠的串联质谱行为。m/z182为2,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸根负离子[M-Na]-，二级谱图可以看到裂解后主要得到m/z80的子离子[SO3]·-，还有少量m/z97的子离子[HDNSO3]-。其质谱谱图和裂解模式示于图6。

图6 2,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸钠的MS/MS谱图和裂解模式Fig.6 MS/MS spectra and fragmentation pattern of sodium 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexyl sulfamate

3 结论

本文以环己酮为原料，以便宜易得的重水为稳定同位素标记源，经过氢-氘交换，还原胺化，磺酰化等关键步骤，合成了2,2,6,6-四氘代环己基氨基磺酸钠。采用多次氢-氘交换的同位素标记策略，保障产物中氘的同位素丰度不低于99%，能很好的作为内标试剂用于甜蜜素的定性定量分析或者示踪剂用于科学研究。