乳制品掺假现状与稳定同位素鉴别技术研究进展

易冰清，郭秀秀，颜 治，赵琼晖，吴凤琪，靳保辉，谢丽琪，吴 浩

(1.深圳海关 食品检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；2.厦门大学 环境与生态学院，福建 厦门 361005)

乳制品的掺假对世界范围内乳品工业的发展来说都是急需解决的问题[1]，其对保障乳品的食品安全具有重要的意义。随着经济和技术的发展，目前我国已成为全球第三大产奶国，同时也是乳制品进口大国，是人均消费量增长最快的国家。仅2018年，我国共进口各类乳制品264万吨，同比增加6.70%。其中，奶粉(含婴幼儿配方乳粉)进口量112万吨，同比增长10.89%，占乳制品进口总量的42.50%，进口额高达9.7亿美元[2]。2008年爆发的三聚氰胺事件使中国乳品行业遭受空前的沉重打击，消费者对国产乳制品的消费信心正艰难恢复，重整乳业需要实施严格的检测和监管。而掺假技术在非法利润的驱使下有随着检测技术不断进步而不断更新的特点，进口乳制品仅对其安全性进行评估，我国极少涉及真实性检测，缺乏相关真实性检测的方法。发展食品真实性检测技术可以对食品生产者起到威慑作用，可在一定程度上重建我国消费者对国产奶粉的信心。本文主要探讨乳制品掺假的现状，对目前比较关注的稳定同位素技术在乳制品掺假鉴别中的研究进展进行阐述，并对目前技术的优劣势进行分析，旨在为进一步完善监管和检测技术手段提供参考。

1 乳制品掺假与检测现状

乳制品的掺假主要有三个方面：一是非法添加外来物(表1)，如已经被媒体公开报道过的掺水、尿素、糖、淀粉以及三聚氰胺等。这类已知的掺假方式相对容易检测，我国有一系列检测方法和标准，如密度法、凯式定氮法、格林试剂法、液相法等。二是伪造高品质(表2)，例如复原乳冒充液态奶，非有机奶冒充有机奶，以及为了提高表观蛋白含量的外源氮非法添加等[3]。这些掺假现象均是针对目前已有标准“量身定制”的掺假手段，具有极强的隐蔽性。虽然目前已有标准NY/T939—2016《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》对复原乳冒充液态奶的鉴别，但该方法未上升为国家强制标准，且方法容易出现误判[4]，未得到市场和监管部门的认可。三是产地造假(表3)，有研究表明，相较于中国品牌，消费者对欧盟品牌具有最高的购买意愿，新西兰品牌次之[5]，因此欧洲和新西兰奶粉可能更容易被其他产地冒充。其次，造假奶粉仍然是以真实的奶源作为原料，仅是对其价值属性进行伪造，导致产地的鉴别比掺假复杂。近年来乳制品掺假的研究方法多局限于对已知添加物的检测，采用的方法多为光谱法，化学法等常规方法，且对产地判别的研究并不充分，需要开发新的检测方法对奶粉的各种掺假模式进行检测。

表1 乳制品非法添加物的检测方法Table 1 Detection methods of illegal additives in dairy products

表2 不同类别乳制品冒充造假的检测方法Table 2 Detection methods of fake dairy products

表3 乳制品原产地造假的检测方法Table 3 Detection methods of dairy products in the country of origin

2 稳定同位素掺假鉴别技术应用

2.1 稳定同位素比值的表达方式

同位素是指具有相同质子数不同中子数的元素，他们互为同位素，而稳定同位素是不具有放射性的同位素。同位素的差别通常用同位素丰度表示，同位素丰度是指某一元素的各种同位素的相对含量(以原子百分计)。一般轻元素(质子数小于27)质量数较轻的同位素的丰度占绝对优势，较重的同位素含量极低，用绝对丰度表达其差异相对困难，并且表示方式繁琐，所以国际上使用相对量表示同位素的富集程度[20]。计算公式为:

δ(‰)=(R样品/R标准-1)×1 000

R样品和R标准分别代表样品和标准物质中的重同位素丰度和轻同位素丰度比，例如C、N、H、O稳定同位素比率可分别用δ13C、δ15N、δ2H、δ18O表示，其丰度比表现为13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O。除了这些较轻的元素外，其他相对较重的元素同位素由于具有比较接近的丰度，因此一般以相对丰度表示，如11B/10B，210Pb/208Pb以及88Sr/87Sr等[24]。

2.2 稳定同位素比值的测定方法

生命元素的稳定同位素丰度的测定需要用稳定同位素质谱(IRMS)进行测定。IRMS是通过外部设备将C、H、O、N和S等相对质量较轻的生命元素转化成相应的气体，再进行一定的化学反应组成特定的气体，例如：C→CO2、N→N2、C→CO以及S→SO2。然后在离子源作用下使气体带电，不同质荷比的气体成分在磁场中偏转角度不同，最后通过法拉第杯接收不同同位素组成的成分并根据矫正过的参考气计算其丰度和同位素比值。但近10年来光谱分析技术在水和CO2气体同位素分析方面以其快速、低价以及简便的特点受到了广泛的关注。目前的主要测定方法如可调谐二极管激光吸收光谱法(tunable diode laser absorption spectroscopy, TDLAS)以及光腔衰荡激光光谱同位素分析仪(cavity ring-down spectroscopy, CRDS)等，主要用于野外生态观测分析[20]。重元素的稳定同位素则需要用到多接收-电感耦合等离子质谱(MC-ICP-MS)或者热电离质谱(TIMS)，其主要原理是采用热电离方法将同位素等离子化，质量数不同的带电粒子通过磁场偏转后被不同的接收器接收产生电信号，从而可对重元素的稳定同位素比值进行分析。

2.3 稳定同位素的应用原理

稳定同位素具有整合、示踪以及指示的作用[20]。生物体的稳定同位素受到不同的生物地球化学作用，产生同位素分馏效应，根据生物体同位素自然分馏的结构实际上是生物体所处环境的“自然指纹”，进而对其进行掺假鉴别和产地溯源。稳定同位素可以反应生物和生物制品的气候、地形、土壤等自然环境条件，生物自身的代谢，人为因素等。生物体生存期间，会与外界环境发生连续且广泛的物质交换，动物呼吸的空气、饮用的水、进食的食物决定了自身的同位素组成。生物体自身代谢过程也会发生同位素分馏，研究发现，生物体对特定元素的分馏遵循一定的规律，如食物被消化吸收的过程中，δ15N值会随营养级的升高而富集，一般每营养级增加3‰～4‰，δ13C值增加0‰～1‰[21-22]。不同的元素在不同的生物化学过程中其分馏效应形成机理具有明显的特点，这些基本的同位素分馏和变化原理为乳制品的掺假鉴别和产地溯源提供了很好的指示作用。

2.3.1碳和氮同位素 碳氮稳定同位素(12C和13C，14N和15N)技术在乳制品的产地溯源和有机奶鉴别方面具有较好的应用潜力。对于碳稳定同位素其主要原理是不同类型饲草的δ13C值不同，C3植物饲草(青草、干草、大豆等)的δ13C值较低(-22‰～-28‰)，C4植物饲草(玉米、高粱等)的δ13C值较高(-10‰～-20‰)[25]。动物在利用食物的过程中虽然存在不同程度的同位素分馏现象，但从整体上看，动物的同位素组成还是由食物的同位素组成决定，并且分馏如前所述，存在一定规律。所以，进食不同比例类型的饲草后产出的牛奶稳定同位素值会有一定差异。例如，有机牛奶和普通牛奶的区别主要就是奶牛饲养方式的不同，有机养殖过程必须放牧，奶牛进食的牧草几乎全是C3植物，而一般工厂化牛奶生产会将奶牛集中喂养，饮食中相对价格便宜的玉米等C4植物占主要成分。这样两种饲养模式下奶牛产出的牛奶δ13C值有所不同，所以可以通过检测牛奶中碳元素的同位素组成，判别有机和非有机牛奶。Bontempo[26]等通过碳稳定同位素和其他微量元素联用准确测出意大利阿尔卑斯山不同的奶酪品种，正确率区分的概率达到94%～100%；并联合奶酪中酪蛋白和甘油两者的碳同位素值估算出奶牛膳食中玉米的比例；Kornexl[27]在1997年就发现利用牛奶中酪蛋白的碳氮同位素比和牛奶水的氧同位素比结合地理上的同位素的数据库可以有效追踪牛奶的原产地。

氮的稳定同位素有15N和14N。牛奶中的氮元素主要来自奶牛每天进食的牧草。牧草有固氮牧草和非固氮牧草，前者可以固定空气中的氮气(δ15N值为0‰)。研究表明，固氮植物固氮过程中氮同位素的分馏很小，因此固氮植物的δ15N值接近空气的δ15N值，其值接近0‰[15]。非固氮牧草的氮元素来源主要为土壤中氮盐成分，主要为硝态氮和铵态氮，植物对其吸收和同化过程有较大的同位素效应，主要变化为被吸收、同化的氮元素15N丰度比吸收、同化前富集。动物进食后，吸收利用食物中的营养成分过程中会存在明显的氮同位素分馏，而且是有规律地富集15N，一般每营养级增加3.3‰[20]。因此，奶牛进食不同牧草，或者进食固氮和非固氮成分比例不同的牧草后，其所产牛奶的氮同位素比值信息在牛奶相应的含氮成分里有所不同。据此，将牛奶中不同成分的氮同位素比值信息与牛奶产地信息相关联，可以对牛奶进行有效鉴别和溯源。

2.3.2氢和氧同位素 自然界中氢元素与氧元素大部分是以水的形式存在，同位素分别为H、D和16O、18O。水中氢氧同位素组成与地理位置和气候条件有关，不同环境中水的δD和δ18O值具有显著差异。奶牛体内的氢氧元素主要来源有：饮用水、食物以及食物中的水，其中饮用水对牛奶中水的δD和δ18O的值影响最大。饮用水进入奶牛体内，影响奶牛体液及蛋白组织的同位素组成，使奶汁中水及蛋白质中的氢氧稳定同位素比率反映生活水域的地理特性。由于植物的蒸腾作用，饲料中水的δD和δ18O值会相对偏正，进而使牛乳中水的δD和δ18O值比奶牛饮用水中略微偏正。根据文献研究的氢氧稳定同位素分馏过程，可大致显示牛奶生产过程中氢氧稳定同位素的变化过程(图1)。不同季节植物饲料的含水量不同，牛奶中水的δD和δ18O值要比地表水偏正2‰～6‰[20]。如果用地下水配制复原奶，牛奶中混入不同比例的复原奶，δD和δ18O的变化会同复原奶的加入比例呈现良好线性，因此能从一定程度上进行复原奶的鉴别[30]，如ChessonL等[31]调査了美国不同地区的生牛乳、奶牛饮用水、市售乳、自来水的δD和δ18O值，发现牛乳水的δD和δ18O值与奶牛饮用水的δD和δ18O值线性关系显著，这个发现在判定牛奶的产地中具有重大意义；Magdas等[33]对罗马尼亚特兰西瓦尼亚地区的牛奶同位素研究表明，牛奶的δD和δ18O值随饮食因素出现夏季较冬季高的现象，牛奶δD和δ18O值平均比饮用水的高1‰和4.5‰，最富集重同位素的牛奶大概会出现在奶牛哺乳期的第二或第三个月。对乳制品生产过程中氢氧稳定同位素分馏机制的研究可以更好的帮助理解乳制品中氢氧稳定同位素比值与产地来源的关系。

图1 牛奶中氢氧同位素的来源及分馏过程Fig.1 Sources and fractionation of hydrogen and oxygen isotopes in milk

2.3.3其他元素同位素 硫(S)的同位素32S和34S主要通过植物根部吸收进入食物链，其同位素组成具有明显的地域特征，影响硫元素同位素组成的因素主要有：距海岸线的距离、当地的地质构造、和当地的空气污染状况等[34]。在进行两种产地气候相近，地址特点显著不同的牛奶区分时，仅仅应用氢氧同位素不能较好地区别牛奶产地时，δ34S值有望为牛奶鉴别和溯源提供更有价值的信息。Crittenden等[34]研究发现，多种元素结合分析会大大提高牛奶产地辨别的准确率。需要注意的是，在利用硫同位素值对牛奶的原产地溯源分析时，应该综合考虑地质、气候、当地生态环境等多种因素，防止人为等因素干扰导致误判，以便更好地发挥硫同位素在牛奶溯源中发挥纠正、辅助的作用。

铅(Pb)作为溯源元素，因其物理性质稳定、存在范围广，较早地应用在污染源示踪、食品产地溯源等研究中。在示踪和溯源研究中，其检测指标一般为207Pb/206Pb和208Pb/207Pb[35]。不同地区土壤来源，形成时间，成因机制不一样，所含铅同位素组成也会有较大差异，具有不同的铅同位素标记特征，这样的特征使铅同位素比值成为一种“指纹”，反应含铅物质的地理位置信息[36]。动物会从饮食中摄入一定的含铅物质，经过代谢吸收会有一部分进入到牛奶中，所以，铅的同位素比值信息可以反应牛奶的产地信息。另外，大气沉降过程携带的铅也会被植物吸收[15]，影响牛奶中铅稳定同位素比值，而且来源于大气的铅可能要高于植物从沉积物吸收的铅[37]，因此，牛奶中铅同位素组成不仅包含原产地地质、气候信息，还可以反映这一地区的污染。需要更多地了解当地的环境背景才能更好地利用铅同位素进行牛奶的产地溯源。

锶(Sr)的同位素中应用较多的是87Sr/86Sr，影响其值的主要因素有地质年龄、地质背景等[38]。与铅同位素类似，锶同位素的物理性质也非常稳定，在生物地球化学过程中不会发生明显的同位素分馏。目前为止，还未发现锶由岩石风化为土壤、被植被吸收利用过程中发生同位素分馏现象[39]。牛奶中锶元素含量比铅要高得多，所以，锶元素同位素比值可以作为一种指示元素，判断牛奶产地的来源[40]。Fortunato等[40]在对瑞士部分地区的奶酪产地研究中发现，锶元素是一种更高效的溯源元素。测试精度方面，锶同位素的分析精度要比铅同位素高一个数量级，可以区别更细微的差别。此外，在气候差异不大的地区，锶同位素的判别效果显著优于δ18O和δD。因此，锶同位素在牛奶等农产品溯源和真伪鉴别研究领域具有巨大的潜力[41]。

表4总结了以上文中稳定同位素技术在掺假鉴别和产地溯源中的一般应用方式和影响因素。

表4 稳定同位素在掺假和产地鉴别中的应用Table 4 Application of stable isotope in adulteration and origin identification

3 乳制品掺假鉴别研究进展

现阶段新型乳制品的掺假检测方法仍然没有上升到国家标准的层面，表明这一问题还没有得到充分的解决。常规的掺水，掺尿素，三聚氰胺和糊精等掺假形式已经有一些检测方法，但是复原乳冒充液态乳，牛奶中外源氮检测，进口奶粉的产地溯源，有机乳制品的鉴别仍然无法得到有效的检出和监管。稳定同位素技术的应用可提供可靠有效的检测方法。

3.1 复原乳冒充鲜牛奶

复原乳是奶粉勾兑还原而成的牛奶，我国规定，低温巴氏奶绝不允许使用复原乳。目前复原乳的主要检测手段是高效液相色谱法检测乳制品中的糠氨酸含量，该方法灵敏度高，但样品前处理时间约24 h，耗时较长，前处理复杂。由于复原乳一般需要加入外来的水源，因此氢氧稳定同位素的检测理论上可克服前处理复杂、费时长等缺点，提供可靠有效的检测方法。Lin等[30, 42]对鲜牛奶和复原乳中水的氢氧稳定同位素进行分析指出，两者存在显著的差异。Ehtesham等[43]指出牛奶中的水比其饮用水富集30%的氘，且牛奶中水、固形物以及脂肪酸中的δ2H与食物和饮用水中的δ2H密切相关。这些研究均为利用氢氧稳定同位素比值鉴别复原乳冒充纯牛奶提供了理论依据。另有研究表明，高温会导致牛奶中的δ13C和δ15N发生改变，提出可通过加工类型来区分样品的概念[18]，但该方法未有进一步的研究支撑。因此采用稳定同位素技术对鲜牛奶的掺假检测理论上可行，但需要更多的验证数据进一步明确检出限、判定值以及适用范围。除稳定同位素外，刘欢等[44-45]还报道了采用同步荧光技术检测鲜牛奶中掺杂复原乳的研究，结合PLS-DA模型，可以实现对鲜牛奶中复原乳的定性检测，但目前的研究对鲜牛奶中添加复原乳的定量检测仍然无法准确实现。

3.2 外源氮的非法添加

目前乳制品中外源氮的检测手段主要基于已知掺假物的检测，而对于未知的氮源则无能为力，因此需要开发非靶向的外源氮检测方法以降低企业和监管的风险。目前已经发现的掺氮类物质主要包括非蛋白氮类化合物(如三聚氰胺、尿素、铵盐等)和非乳源蛋白类物质(如大豆蛋白，水解蛋白、乳清粉等)，其氮稳定同位素比值均有各自的分布特点。李鑫等[46]对不同国家奶粉中碳氮稳定同位素的分析表明，大部分乳粉的氮稳定同位素比值介于6‰～8‰之间，常见化工类高氮化合物如尿素、三聚氰胺δ15N为负值，因此低于此区间的奶粉样品可能添加有外源氮。且按蛋白含量10%的比例加入三聚氰胺后，奶粉的氮稳定同位素比值由6.34‰降至5.66‰，同位素质谱分析氮稳定同位素比值的精度一般为0.2‰～0.3‰，因此该变化差异满足乳制品中外源无机氮的识别需求，理论上可对添加10%外源氮的识别。乳制品的氮稳定同位素比值分析多用于对有机奶和非有机奶的鉴别[16]，在乳制品外源氮检测方面的研究还比较少，需要更多的收集不同产地奶制品的氮稳定同位素比值数据，确定其真实性范围以实现对外源氮掺假检测的判定。

3.3 婴幼儿配方奶粉的产地造假

自从2008年三聚氰胺事件后，我国奶粉(特别是婴幼儿配方奶粉)进口量巨大[47]。且我国消费者更信赖欧洲，澳洲和新西兰的配方奶粉，国产配方奶粉的信任度较低[48]。因此配方奶粉的产地造假存在较大的经济利益，配方乳粉的产地真实性具有潜在的安全风险和监管漏洞。为了满足婴幼儿的营养需要，在奶粉中加入各种营养成分，以达到接近母乳的效果。与普通奶粉相比，奶粉在配方中去除了部分酪蛋白，增加了乳清蛋白；去除了大部分饱和脂肪酸，加入了植物油，DHA(二十二碳六烯酸，俗称脑黄金)，AA(花生四烯酸)配方奶粉中还加入了乳糖，含糖量接近人乳；降低了矿物质含量，以减轻婴幼儿肾脏负担；另外还添加了微量元素、维生素、某些氨基酸或其他成分。因此对于婴幼儿配方奶粉的产地溯源而言，常规的总体(bulk)稳定同位素分析以及元素分析均不完全适用。本课题组前期对200多份配方奶粉的碳氮氢氧稳定同位素进行了分析，结果表明配方奶粉的同位素变化范围远大于纯牛奶固形物(未发表数据)，添加剂对奶粉总体同位素具有显著的影响，但仍能在一定程度上实现不同国家配方奶粉的区分。梁莉莉等[49]利用EA-IRMS测定了酪蛋白δ13C 和δ15N 值，分析发现酪蛋白的δ13C和δ15N与产地有很大相关性，不同地区样品有各自的地域特点。酪蛋白是配方奶粉中需要减少的，不受添加成分的干扰，可作为产地溯源指标。相比其他类别乳制品的产地溯源研究[27, 50]，配方奶粉的产地溯源方法和研究仍然较少，也是乳制品真实性鉴别的重点研究方向。

3.4 普通乳制品冒充有机乳制品

对于有机产品我国制定国标GB/T 19630和《有机产品认证实施规则》等的相关规定,但仅靠产品的有机认证难以保证有机乳制品的真实性。目前，国内没有明确的检测技术可以精准鉴别有机制品，难以采取有效的控制和防范措施。Ⅲ-Min Chung[15]研究发现有机牛奶的δ15N值总是比非有机牛奶的低，同一地点，不同月份的牛奶，氮同位素值有所不同。这与Molkentin & Giesemann[16]和Molkentin[29]的研究结果一致，但Bateman & Kelly[23]的研究结果却相反。赵超敏等[51]研究发现有机奶粉的δ13C较非有机奶粉的δ13C偏负，有机奶粉的δ15N较接近。说明碳、氮稳定同位素作为有机牛奶的鉴别情况要比植物复杂的多，需要更多的考虑奶牛食物是否有机种植，饲料种植土壤的氮本底值等因素。Ⅲ-Min Chung等[52]的研究进一步指出特定化合物的同位素数据，如脂肪酸和氨基酸的同位素，在总体稳定同位素区分能力不足的情况下，可提高有机乳制品验证的可靠性。同位素比质谱技术可能是一个很好的鉴别有机乳制品真实属性的可靠技术，但需要更系统的研究明确有机和非有机生产的乳制品同位素分布范围，从而实现更准确的鉴别效果。

4 小结与展望

乳制品的掺假主要是经济利益驱动的造假现象(economically motivated adulteration, EMA)，且由低端的加水、淀粉和外源氮等加量的手段转向低质产品冒充高质产品的增质转变。稳定同位素技术在掺假鉴别和产地溯源中有突出优势，该技术通过追溯和识别乳制品生产的基本生物学过程的稳定同位素变化实现真实性鉴别和产地溯源，可有效解决这些掺假问题。

同位素技术虽然能提供强大的掺假鉴别能力，但在乳制品的真实性鉴别中依然缺乏系统的理论支撑。不同的生物学过程、环境因素以及生产加工过程对乳制品稳定同位素的影响效应和机制研究仍然十分缺乏，这将导致稳定同位素技术在本领域研究缺乏系统性和推广性。比如，1) 饲料、饮用水等生产资料与乳制品中同位素之间的关系还没有完全理清。2) 有机与非有机奶中碳氮稳定同位素的差异仍然具有不确定性，需要更系统的实验设计予以明确。3) 配方奶粉中外来添加物对原料奶的稳定同位素比值以及产地溯源可靠性的影响也未充分评估。这些机理的充分研究有利于制定有效、稳定的真实性鉴别技术标准，让研究结果走向技术应用。

我国是乳制品进口大国，在进口乳制品质量安全监管、原产地识别方面具有较大的技术需求，特别是婴幼儿配方奶粉还需要研究快速可靠的掺假和产地溯源技术方法以适应我国监管需求。而对于我国乳制品企业，该技术可运用于对原料奶和进口乳粉的非法添加以及原产地问题进行鉴别，为企业降低食品安全风险。但目前的研究仅提供了稳定同位素技术在乳制品掺假和产地溯源上的可行性，而实现真实性判定需要基于大量的数据积累，与企业联合开展相关的研究和数据库建设是有效的解决方案。