柚皮中柚皮苷提取条件优化及其贮藏条件分析

王娟娟，贾金萍，张俊杰

山西大学大型科学仪器中心（太原 030006）

柚子是芸香科柑橘属的一种水果，其果实鲜食甘酸可口，沁人心脾，令人赞不绝口，具有消炎防菌、化痰止咳、理气清肠、下气消食、补血健脾等功效。柚子是佳果，又是良药。然而，厚厚的柚皮往往被弃之不用，其实柚皮不仅可作为居室里的空气清新剂，还有食疗功效。柚皮占整个柚子质量的40%～55%[1-2]，不仅含有维生素和矿物质这些人体必需的营养素，还含有多种对人体健康有益的非营养性生理活性成分，如黄酮类化合物、多糖、果胶、香精油等，这些成分高于柚果实，具有较高保健和药用价值[3-8]。

柚皮苷（naringin）全称4, 5, 7-三羟基-黄烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，是一种二氢黄酮类化合物，主要存在于柚、橘、橙等柑橘类水果的外层果皮中。柚皮苷具有抗炎镇痛、抗氧化、平喘、镇咳、祛痰、抗衰老、降血脂、抗动脉粥样硬化等广泛的生物活性，是重要的医药原料。试验研究大都集中于柚皮中柚皮苷的提取纯化方面[6,9-13]，很少关于直接饮用柚皮水的研究报道。

网上和民间都流传着许多种简单可行的柚子皮治疗咳嗽的做法，如开水冲泡、沸水煎煮等服用方法[14-17]。柚皮虽是止咳良药，但尚缺乏科学依据证明其有效性及如何才能使其更有效。

因此，采用高分辨液质联用仪分析测定开水冲泡和沸水煎煮柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量，研究干燥后及-18 ℃冷冻期间柚皮水提液中柚皮苷含量的变化规律，为合理用药提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜柚皮取自琯溪蜜柚，产地为福建省。

甲醇、乙腈、乙酸（色谱纯，Thermo Fisher Scientific公司）；柚皮苷对照品（百灵威科技有限公司）；纯净水（娃哈哈）。

1.2 仪器与设备

Thermo fisher U3000超高效液相色谱仪，配置在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、自动进样器（Thermo Fisher Scientific）；Thermo Scientific Q Extractive质谱仪（Thermo Scientific，Germany），Syncronis C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；十万分之一天平（奥豪斯仪器有限公司）；美的电磁炉；海尔冰箱。

1.3 方法

1.3.1 检测条件

色谱条件：色谱柱Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相，乙腈（A），0.1%乙酸水（B）。梯度洗脱：0～0.5 min，5% A；0.5～3 min，5%～95% A；3～5 min，95% A；5～5.2 min，95%～5%A；5.2～7 min，5% A；流速0.25 mL/min；柱温45 ℃；进样量1 μL。

质谱条件：离子源，电喷雾离子源（ESI）；扫描方式，负离子同时扫描；喷雾电压2.7 kV；鞘气流速35 psi；辅助气流速10 psi；毛细管温度320 ℃；探头加温器温度300 ℃；最大喷雾电流100 A；S-Lens分辨率55；扫描范围m/z150～1 000；质量分辨率70 000。

1.3.2 对照品溶液的制备

精密称取10.0 mg柚皮苷对照品置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备

1) 采用开水冲泡、沸水煎煮2种方法。具体过程：将鲜柚皮切成1 cm×2 cm大小的块，精密称取5.0 g柚皮，分别用100 mL开水冲泡3，5，10，15和20 min，适量沸水煎煮3，5，10，15和20 min，将水提液移至100 mL容量瓶中用纯净水定容，摇匀，微孔滤膜（0.22 μm）过滤后作为供试溶液。

2) 将一部分鲜柚皮块自然晾干（含水量78.34%），精密称取1.1 g干柚皮，用适量沸水煎煮15 min，将水提液移至100 mL容量瓶中用纯净水定容，摇匀，微孔滤膜（0.22 μm）过滤后作为供试溶液。

3) 将剩余鲜柚皮块置于-18 ℃冰箱中保存，分别在冷冻2，4，6和8个月时取样检测，每次精密称取5.0 g柚皮，用适量沸水煎煮15 min，将水提液移至100 mL容量瓶中用纯净水定容，摇匀，微孔滤膜（0.22 μm）过滤后作为供试溶液。

按1.3.1的液相色谱及质谱条件进行检测，柚皮苷标准品和柚皮苷试验样品的提取离子图见图1和图2。

图1 柚皮苷标准品的提取离子流图

图2 柚皮苷样品的提取离子流图

1.3.4 标准曲线的建立

分别精密吸取0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mL对照品溶液，分别置于10 mL量瓶中，用纯净水定容至刻度，摇匀。以峰面积积分值为纵坐标，柚皮苷对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为Y=4.654 88×107X+1.653 87×107（R2=0.998 7），线性范围为4.738～39.446 μg。

1.3.5 精密度试验

以开水冲泡10 min柚皮水溶液进样1 μL，连续重复6次，测定峰面积，柚皮苷相对标准偏差RSD为0.96%。

1.3.6 稳定性试验

取沸水煎煮3 min柚皮水溶液，每隔1 h进样1 μL，观察6 h内稳定性，RSD为2.90%。

1.3.7 重复性试验

称取6份同一批柚皮，各5 g，分别用沸水煎煮3 min后进样1 μL，柚皮苷峰面积的RSD为2.46%，表明方法重复性良好。

1.3.8 加样回收率试验

精密称取9份5 g柚皮，分别加入低、中、高3个浓度的柚皮苷对照品（分别相当于开水冲泡10 min柚皮水溶液中柚皮苷含量的80%，100%和120%），按1.3.3的方法开水冲泡10 min柚皮制备供试品溶液，取1 μL进样测定，计算含量，求得平均回收率为98.11%，RSD为1.53%。

1.3.9 数据分析

数据的统计分析采用SPSS 16.0 for Windows（SPSS Inc.，USA）软件进行方差分析，用Tukey法进行多重比较，p＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 柚皮中柚皮苷提取条件

柚皮苷易溶于热水，通过加热处理可使其溶出[11]。根据柚皮苷特性，分别研究不同开水冲泡时间、沸水煎煮时间对柚皮中柚皮苷溶出量的影响。

2.1.1 开水冲泡时间的确定

开水冲泡柚皮不同时间后，柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量的变化如图3所示。在3～20 min内，随着开水冲泡时间增加，柚皮水提液中柚皮苷含量基本呈现逐渐增加趋势。开水冲泡柚皮5和10 min时水提液中柚皮苷含量无显著差异（p＞0.05），开水冲泡柚皮20 min时水提液中柚皮苷含量升高到11.61 μg/mL，显著高于冲泡3，5，10和15 min时（p＜0.05），开水冲泡柚皮20 min后，水温较低，不适宜饮用。综合考虑，开水冲泡柚皮20 min较为适宜。

图3 开水冲泡时间对柚皮水提液中柚皮苷含量的影响

2.1.2 沸水煎煮时间的确定

沸水煎煮柚皮不同时间后，柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量的变化如图4所示。在3～20 min内，随着沸水煎煮时间增加，柚皮水提液中柚皮苷的含量呈现先增加后下降趋势。沸水煎煮柚皮5，10，15和20 min时水提液中柚皮苷含量均显著高于3 min时（p＜0.05），沸水煎煮柚皮15 min时水提液中柚皮苷含量达到最大值（24.36 μg/mL），继续煎煮，柚皮苷含量下降。沸水煎煮柚皮20 min时降至19.62 μg·mL-1，与煎煮5和10 min时相比差异不显著（p＞0.05）。这一结果表明，煎煮20 min时间过长，过度加热会导致柚皮苷的分解，从而导致柚皮苷含量降低，类似的结果在文献[18-19]中提及。因此，最佳沸水煎煮柚皮时间为15 min。

图4 沸水煎煮时间对柚皮水提液中柚皮苷含量的影响

2.1.3 柚皮有效利用方法的确定

在试验分析基础上，将开水冲泡20 min、沸水煎煮3 min、沸水煎煮15 min时的柚皮水提液中柚皮苷含量作比较，如图5所示。开水冲泡柚皮20 min和沸水煎煮柚皮3 min这2种方法的水提液中柚皮苷含量无显著差异（p＞0.05），推测其止咳化痰效果基本相同。与开水冲泡柚皮20 min时相比，沸水煎煮柚皮15 min时水提液中柚皮苷含量显著提高（p＜0.05），由此可见，柚皮苷易溶于热水，通过加热处理可使柚皮苷溶出更多，该结论与杨秋明等[11]的研究结果一致。因此，确定沸水煎煮柚皮15 min为柚皮有效利用的最佳方法。

图5 柚皮不同利用方法的比较

2.2 干燥对柚皮中柚皮苷含量的影响

柚皮干燥后，沸水煎煮柚皮15 min时水提液中柚皮苷的含量下降为鲜柚皮的58.58%（p＜0.05），如图6所示。结果表明，柚皮苷在干燥过程中有显著降解，将柚皮干燥后存放，并不能有效利用柚皮。

2.3 冷冻期间柚皮中柚皮苷含量的变化

为延缓柚皮苷的降解，将鲜柚皮块置于-18 ℃冰箱中冻藏。冷冻8个月后进行水提，柚皮水提液中柚皮苷含量测定结果如图7所示。冷冻后柚皮苷含量同样呈明显下降趋势（p＜0.05），但其下降速度较干燥后小得多，柚皮中柚皮苷分别在第2和第4个月时有显著降解，其中第2个月水提液中柚皮苷含量为未冻藏时的85.39%，第4个月为未冻藏时的70.69%；而第4～6个月呈缓慢下降趋势，差异不显著（p＞0.05），6个月以后又快速下降，至第8个月时，柚皮水提液中柚皮苷含量已下降为未冻藏时的45.53%，柚皮化痰止咳效果大大降低。

图6 干燥后柚皮水提液中柚皮苷含量的变化

图7 冷冻期间柚皮水提液中柚皮苷含量的变化

3 讨论与结论

柚皮味辛甘苦，性温，无毒，具有化痰，消食，下气，快膈等功效，在《唐本草》《本草求原》《列子》《本草纲目》《四川中药志》等文献中均有记载[20]。采用开水冲泡、沸水煎煮方法提取柚皮中的止咳化痰成分柚皮苷，并用GC-MS分析，同时研究干燥后及-18 ℃冷冻期间柚皮水提液中柚皮苷含量的变化规律。结果表明，鲜柚皮沸水煎煮15 min水提液中柚皮苷含量最高，可达24.36 μg/mL；柚皮干燥后，柚皮水提液中柚皮苷含量下降至14.27 μg/mL，柚皮苷有显著降解；鲜柚皮冷冻2，4，6和8个月后，水提液中柚皮苷含量分别为未冻藏时的85.39%，70.69%，65.60%和45.53%，柚皮苷含量冷冻2个月和4个月时下降极显著，冷冻4个月到6个月之间变化不大，6个月以后又快速下降。因此，选择沸水煎煮15 min作为柚皮利用的最佳方法，将鲜柚皮冷冻可有效延缓柚皮苷的降解，冷冻保存不超过6个月为宜。在民间，柚皮用于止咳历时已久，但缺乏合理应用的科学依据，试验为有效利用柚皮这一天然资源提供参考依据。