自拟活血益气滋阴方对糖尿病周围神经病变患者NLRP3炎性小体及下游炎症因子水平的影响

王志敏 李建欣 白 艳

糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病患者常见的并发症之一，在2型糖尿患者中发生率能达到60%～90%[1]，其发生与糖尿病患者机体慢性炎症反应密切相关[2]。NLRP3炎性小体是一种存在于细胞质中的蛋白复合物，依赖半胱天冬蛋白酶-1(caspase-1)的分子平台促进白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的成熟和释放，并引起炎症反应[3]。研究[4]指出，NLRP3炎性小体激活是糖尿病发展的重要环节之一，一旦体内对NLRP3炎性小体的调控失衡，可能生成过量的IL-1β、IL-18，引发一系列的糖尿病并发症。西医治疗DPN主要以降糖、降脂、营养神经、改善微循环等综合性治疗，但由于DPN的发病机理尚不十分明确，影响因素复杂多样，目前仍缺乏有效的治疗方法。在中医范畴中，糖尿病被称为消渴症，基本病机是阴虚为本，燥热为标，故清热润燥、养阴生津为本病的治疗核心宗旨。既往研究[5，6]证明，益气活血滋阴治疗糖尿病相关并发症，可以有效缓解并发症相关症状，改善相关指标水平，提高患者的生存质量，但目前此方面的研究尚无关于是否能改变炎性指标的结论。因此，我院在常规治疗的基础上，结合自拟活血益气滋阴方治疗DPN患者，观察NLRP3及其下游炎症因子的水平变化，旨在为临床应用提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年1月—2019年12月于我院住院治疗的DPN患者152例，其中，男84例，女68例；年龄38～65岁，平均年龄(57.46±6.57)岁；病程4.5～11年，平均病程5.68(2.30，9.91)年。采用随机数字表法，将研究对象随机分为研究组和对照组均76例，2组性别比例、年龄、糖尿病病程、体质量指数(BMI)、血糖控制情况等一般资料比较，差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)，见表1。本研究设计符合《赫尔辛基宣言》标准。

表1 2组患者一般资料比较 [例，

1.2 诊断标准T2DM和DPN西医诊断符合《中国2型糖尿病防治指南(2017年)》[7]诊断标准：①明确的糖尿病病史；②诊断糖尿病时或之后出现的神经病变；③临床症状和体征与DPN的表现相符；④有临床症状(疼痛、麻木、感觉异常等)者，5项检查(踝反射、针刺痛觉、震动觉、压力觉、温度觉)中任1项异常；无临床症状者，5项检查中任2项异常，临床诊断为DPN。中医诊断符合《糖尿病周围神经病变中医防治指南》标准[8]：①有糖尿病病史或诊断糖尿病的证据；②出现感觉、运动神经病变的临床表现；③神经电生理检查异常改变，物理学检查、感觉定量试验和神经传导速度中至少2项异常。

1.3 纳入标准①年龄>18岁；②T2DM和DPN诊断符合《中国2型糖尿病防治指南(2017年)》[7]诊断标准；③中医诊断符合《糖尿病周围神经病变中医防治指南》[8]标准；④签署知情同意书。

1.4 排除标准①合并其他原因引起的神经病变；②合并严重动静脉血管性病变；③合并恶性肿瘤、严重心血管疾病、严重肝肾功能不全；④因药物引起神经毒性和代谢毒物造成神经损伤；⑤1型糖尿病、特殊类型糖尿病；⑥对试验药物过敏；⑦妊娠期和哺乳期女性。

1.5 方法

1.5.1 治疗方法2组均接受常规降糖、降压、降脂、改善微循环及饮食运动干预等基础治疗。对照组在此基础上给予甲钴胺片(华北制药股份有限公司，国药准字H20031126)口服，3次/d，每次0.5 mg。研究组在基础治疗的同时，联合使用活血益气滋阴方汤剂，药物组成：生姜180 g，麦冬100 g，五味子80 g，川芎60 g，当归60 g，熟地黄60 g，人参60 g，桂心60 g，炙甘草60 g，远志60 g，龙骨60 g，黄芪30 g，茯苓30 g，大枣20枚，羊肾1枚。制作过程为先煮羊肾，取汁煎余下药材，早晚各服用1次，30 d为一个疗程，连用3个疗程(3个月)。

1.5.2 观察指标分别于干预前、干预1个月及干预3个月后，收集相关指标。①Western blot检测NLRP3和Caspase-1水平：收集患者空腹肘静脉血5 ml，采用磁珠复筛法分离外周血单核细胞，试剂盒购自上海澳赛尔斯生物技术有限公司，将细胞浓度调整至5×105个/ml备用，整个操作严格按照说明书进行。采用预冷磷酸盐缓冲液(PBS，HyClone公司)清洗细胞并离心3次，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后用细胞裂解液提取总蛋白，收集细胞沉淀及裂解液，BCA蛋白定量。然后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜后，5%脱脂奶粉(TTBS缓冲液配置)封闭，4 ℃孵育过夜。分别加入NLRP3、Caspase-1及β-actin一抗(5%脱脂奶粉，1∶1000)，37 ℃孵育4 h，TTBS洗膜，后加入二抗(1∶50000)，37 ℃孵育1 h，TTBS洗膜，加入ECL试剂，曝光，显影，定影，采用Gel-protein软件分析条带灰度。②酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-1β和IL-18的表达水平：收集空腹肘静脉血5 ml，室温静置，离心分离血清，并置于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA检测IL-1β和IL-18的表达水平，试剂盒由加拿大MyBioSource公司生产，购自武汉华美生物工程有限公司，操作步骤严格按照使用说明书进行，批间与批内的变异系数均<10%。

1.5.3 质量控制患者每月于门诊复诊时，门诊医师根据患者检测结果进行常规治疗方案调整，并给予饮食运动教育，但甲钴胺及中药方剂治疗方案持续3个月。在观察期间出现糖尿病急性并发症、急性感染、严重外伤、家中出现变故等应激事件者，为避免对数据的影响导致结果的偏差，故以上情况患者数据不纳入最终的统计。研究中涉及的Western blot实验及ELISA检测均在濮阳医学高等专科学校基础实验室内完成，由李建欣教授指导，所有操作严格按照产品使用说明书进行，批内及批间差异<10%。

2 结果

2.1 2组患者不同时间点NLRP3表达水平的比较重复测量的方差分析显示，不同时间点NLRP3表达水平比较，差异有统计学意义(F时间=117.372，P<0.001)；对照组和研究组不同时间点NLRP3表达水平比较，差异均有统计学意义(F组间=89.341，P<0.001)；测量前后与干预之间存在交互效应(F交互=45.662，P<0.001)，见表2。

表2 2组患者不同时间点NLRP3表达水平的比较 (例，

2.2 2组患者不同时间点炎症因子水平的比较重复测量的方差分析显示，不同时间点Caspase-1、IL-1β及IL-18表达水平比较，差异有统计学意义(F时间=105.441、117.384、129.516，P<0.001)；对照组和研究组不同时间点Caspase-1、IL-1β及IL-18表达水平比较，差异均有统计学意义(F组间=67.376、46.364、58.610，P<0.001)；测量前后与干预之间存在交互效应(F交互=27.348、25.358、16.555，P<0.001)，见表3。

表3 2组患者不同时间点炎症因子水平的比较 (例，

3 讨论

NLRP3炎性小体是核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族NALP组成员之一，与许多炎性疾病有关，如阿尔兹海默症、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病等[9]。研究[10]指出，NLRP3炎症小体及其下游炎症因子激活是糖尿病发展的重要环节，在糖尿病慢性并发症中，受到细胞内特定信号刺激时，NLRP3发生寡聚化，通过PYD结构域招募凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及下游的Caspase-1形成多蛋白复合物，是炎性免疫反应的重要组成部分，其主要作用是诱导后者自我剪切成活化的Caspase-1，促进IL-lβ和IL-18激活，产生成熟的具有活性的IL-lβ和IL-18，促进其他炎性细胞因子的合成和释放，放大局部和全身炎症反应，这其中氧化应激发挥出了非常重要的作用。因此，NLRP3炎性小体成为近年来糖尿病慢性病并发症研究的“新靶点”。

目前，DPN的发病机制尚未完全阐明，对于DPN的预防和治疗造成了一定的影响，但普遍认为其与糖脂代谢异常、炎症反应、氧化应激、微血管病变有关。由于NLRP3炎症小体在糖尿病慢性并发症中的重要地位，寻找靶向于NLRP3炎症小体的治疗药物就具有深远意义。中医学对于DPN治疗具有悠久的历史，其在中医学中被归为“痹证”“血痹”“痿证”等治疗范畴，认为该病主要是由于患者消渴日久，耗损气阴、真阴日益衰损继而及阳，最终导致阴阳气血虚弱，营卫失调、阳虚则血行无力，瘀血凝滞脉络，阻碍血气正常运行，使其不能上达四末而至脉络损伤，临床表现为“麻、凉、痛、痿”。中医学[11]认为，气虚血瘀始终贯穿于DPN发展的始终，其中病机是气阴皆虚、夹以血淤，本虚证和标实证动态演变，气虚是迁移不愈的症结，血瘀是造成本病的主因。因此，本病的临床治疗离不开益气、活血、滋阴等疗法[12]。本研究发现，在经过3个月的干预后，2组NLRP3炎性小体及其下游炎症因子Caspase-1、IL-1β及IL-18的表达水平均降低，提示经过常规的降糖、降脂、营养神经、改善微循环的治疗后，DPN患者炎症状态得到了一定的改善，进一步观察发现，研究组患者1个月和3个月时，Caspase-1、IL-1β及IL-18表达水平低于对照组(P<0.001)，说明给予活血益气滋阴方治疗后，效果更为明显。中药具有双向调节、多靶点、多途径的优点，目前关于中药复方干预NLRP3炎症小体的研究较少。既往研究[6]证实，益气活血中医治疗能够改善DPN患者气虚血瘀症状，缓解局部不适，效果好于甲钴胺单药治疗。活血益气滋阴方在配伍上严格遵循“君、臣、佐、使”的要求，以补阴为主，气阴同治，兼顾痰瘀，清化湿热，注重脾运，以达到五脏六腑通达平和的良好状态。在方剂中，君为黄芪、麦冬，补气固表、滋阴补血。黄芪可补中益气，改善营血虚滞，其药理成分中的黄芪多糖可清除自由基，抗脂质氧化，保护线粒体的结构和功能，在机体抗氧化应激中起重要作用[13]。麦冬具有滋阴生津、健脾益气的功能，用于治疗内热消渴，现代药理研究[14]证明，麦冬具有抗炎、抗氧化、降糖降脂的作用，其总皂苷及各部位提取物对改善炎症均具有较好的作用。臣为熟地黄，通血脉，益气力，主治气血两虚、肝肾亏虚、肾阳虚证等，其水提取液能通过上调T2DM大鼠胰岛素原基因mRNA与蛋白的表达和抑制脂肪组织resistin基因的表达，改善胰岛β细胞功能[15]，且在家兔中进行的实验[16]证明，熟地黄可以抑制血浆cAMP含量过高及cAMP/cGMP比值过高，具有抗炎的作用。另外，方剂中再配以五味子、当归、炙甘草、桂心、茯苓、人参、川芎等，分别归为臣药、佐药、佐使药，起到益气生津、温补气血、补气健脾、通络活血等作用。

综上所述，在糖尿病常规治疗的基础上给予活血益气滋阴方，可以降低DPN患者NLRP3炎性小体及其下游炎症因子Caspase-1、IL-1β及IL-18的表达水平，但本文无法证明导致NLRP3炎性小体及其下游炎症因子下降的具体机制，且目前中医学在此方面的研究较少，此结论还有待进一步确定。