阿拉伯半乳聚糖吸附阿魏酸的特性研究

朱建飞,唐敏,高瑞萍,2,常海军,2

1(重庆工商大学 环境与资源学院，重庆, 400067)2(重庆市特色农产品加工储运工程技术研究中心，重庆, 400067)

近年来，有关生物大分子与小分子相互作用的研究报道越来越多，特别是关于蛋白质(包括酶)和DNA与活性小分子相互作用的研究逐渐成熟[1-3]。但是关于多糖与活性小分子相互作用的研究内容却不多。阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan, AG)是阿拉伯糖和半乳糖组成的中性多糖，在医药、食品、化妆品中应用广泛。美国食品药品管理局已经批准AG可以作为食品添加剂使用。AG的吸水性很强，添加到食品中可以形成一种胶凝体，增加食品的体积，改善食品的软度和口感[4]。阿魏酸(ferulic acid, FA)是酚酸的一种，广泛存在于植物中，是阿魏、当归、川芎、升麻等中药材的有效成分，在医药、化妆品、保健品、食品中有着广泛的应用[5-7]。由于FA不稳定，它的许多应用都会被限制，通常，FA与多糖结合后可以形成更加稳定、更具有靶向活性的复合物，常见于植物细胞壁、烘焙食品、啤酒加工等[8-9]。目前，还未见有AG与FA结合特性研究的文献报道。本文旨在研究AG与FA结合特性，为该复合物在食品、药品等方面应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

阿魏酸(纯度99%),湖北远成药业有限公司；阿拉伯半乳聚糖(纯度>98%),上海伊卡生物技术有限公司；无水乙醇、甲醇(分析纯)，成都科龙化工试剂厂；甲酸、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(分析纯)，重庆川东化工有限公司；CP214型电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；DELTA320-S型PH计，深圳富哲仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；T-18型分散机(配S10N 5G型分散头)，德国IKA公司；UV-2450型紫外可见分光光度计，日本Shimadzu公司；傅立叶变换红外光谱仪，日本Shimadzu公司；HJ-6A型多头磁力搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；XH-B型漩涡混合器，上海达洛科学仪器有限公司；KS-080型超声波清洗机，深圳市洁康洗净电器有限公司；LGJ-18S型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；MD34型透析袋，北京索莱宝科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂。

1.2 检测方法

1.2.1 FA含量测定

首先采用紫外扫描分析法，于200～400 nm波长内对FA的甲醇溶液进行扫描，以确定FA的特征吸收波长。精确称取2.5 mg FA标品，用甲醇溶解并定容至25 mL，制成100 μg/mL的母液，再分别取该溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分别定容至25 mL，摇匀。制成的标准溶液质量浓度为2、4、6、8、12、16 μg/mL。采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法检测FA的含量[6]，流动相：A相： 0.3%(体积分数)甲酸水溶液；B相：0.3%(体积分数)甲酸甲醇溶液，A相与B相体积比为60∶40，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，检测波长322 nm，出峰时间8.1 min。将配制好的梯度FA甲醇溶液按照上述方法测量，记录所得的峰面积，以FA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。计算得到阿魏酸标准曲线的回归方程为Y=77.276X-13.512，R2=0.999 1，式中X为FA浓度，Y为峰面积。

1.3 试验设计

1.3.1 平衡透析试验

取长约10 cm的透析袋，用前进行常规处理，取6 mL质量浓度为0.5 mg/mL的AG溶液和2 mL质量浓度为0.5 mg/mL的FA溶液，放入透析袋中，封好透析袋，将透析袋放入盛有100 mL磷酸缓冲液的烧杯中，将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌，每隔1 h用紫外分光光度计测1次透析外液中FA的吸光度，直至吸光度不变时达到透析平衡,以确定吸附时间。

1.3.2 单因素试验

考察单因素有缓冲液pH、温度和FA浓度。选取的点分别为缓冲液pH:3、4、5、6、7；温度：20、30、40、50、60 ℃；FA质量浓度：1、5、9、13、17 mg/mL。分别将盛有6 mL 0.5 mg/mL AG和2 mL不同浓度的FA溶液的透析袋放入盛有 100 mL不同pH浓度为0.5 mol/L的PBS缓冲液中，透析温度为20～60 ℃，透析平衡后透析袋外液过0.45 μm滤膜后经HPLC测定游离FA含量。每个点进行3次平行实验，根据FA的标准曲线计算AG对FA的吸附量(Qe，μg/mg)。

1.3.3 Box-Behnken设计试验

在单因素试验的基础上，进行Box-Behnken设计试验。选取温度、pH和FA浓度3个因素为自变量(X)，各分3个水平，共15个实验点，可以分为两类，一类是析因点，自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，共有12个析因点；另一类是零点，为区域的中心点，零点实验重复3次，用以评估试验的误差。以AG对FA的吸附量(Qe)为响应值(Y)，运用Design-Expert 8.0软件设计响应面实验并对实验结果进行回归分析，通过响应面分析对试验条件进行优化，Box-Behnken设计试验因素水平取值及编码表见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素和水平Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.3.4 AG - FA复合物的制备

取60 mL质量浓度为0.5 mg/mL的AG溶液和20 mL质量浓度为0.5 mg/mL的FA溶液于透析袋中，将透析袋放入盛有100 mL的磷酸缓冲液的烧杯中透析一定时间，透析平衡时取出透析袋，流水透析24 h，去除大部分杂质，再用蒸馏水透析，每2～3 h更换1次蒸馏水，去除小分子杂质。将透析袋内液取出，旋转蒸发后大大降低透析液的体积，冷冻干燥，制成样品，密封后置于干燥器中保存。

1.3.5 AG-FA复合物结构表征

(1)紫外分光光谱分析

分别把FA、AG、复合物、物理混合物配成质量浓度同为1 mg/mL的溶液，然后用紫外分光光度计在200～350 nm的波长下扫描得到紫外图谱。

(2)傅里叶变换红外光谱分析

分别精确称取2 mg样品，样品分别为FA、AG、复合物、FA和AG质量比为1∶4的物理混合物，其中物理混合物为采用漩涡混合器处理1 min制得。样品与干燥的KBr以质量比1∶50的比例混合在玛瑙研钵研磨成均匀细粉，采用专用的压片设备，制备成薄片[10]。然后分别用傅立叶变换红外光谱仪对样品进行红外扫描。

(3)扫描电子显微镜分析

扫描电镜法是用导电双面胶将样品粉末固定在金属样品平台上，在真空中喷涂铂金后，置于扫描电子显微镜中以 3 kV 电子束观察，拍摄有代表性的样品颗粒的形貌照片[11]。样品分别是AG、复合物和物理混合物，拍摄的照片放大倍数是500和2 000倍放大倍数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 平衡透析实验时间的确定

以透析外液中游离FA的吸光值为纵坐标，吸附时间为横坐标，做出AG对FA的吸附曲线，如图1所示，随着时间的增大，游离FA的浓度逐渐增大，当达到5 h时，FA浓度不再增大，表明AG对FA的吸附在5 h时达到最大。故以下实验采用5 h的吸附时间。

图1 时间对透析外液中游离FA浓度的影响Fig.1 Effect of time on the concentration of free FA in dialysate注：标注不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.1.2 pH对吸附量的影响

pH是影响吸附过程的重要影响因素之一。它与吸附剂表面的吸附机制有关，并且反映了吸附剂与吸附之间理化作用的本质[12]。本实验中FA质量浓度设定为0.5 mg/mL，温度为25 ℃，pH为3～7，试验结果如图2所示。随着pH增大，AG对FA的吸附量显著增大，当pH为5时，达到最大吸附量，为81.62 μg/mg。当pH再增大时，吸附量则减小。吸附量随透析外液pH波动的现象可能是由于阿魏酸是弱有机酸，在水溶液中易受溶液pH值影响而发生变性、异构化、产生沉淀等。

图2 透析外液pH对吸附量的影响Fig.2 Effect of pH of dialysate on the adsorption capacity of FA on AG

2.1.3 温度对吸附量的影响

根据pH对吸附量的影响结果，将缓冲液的pH设定为5，FA质量浓度为0.5 mg/mL，温度设定为20～70 ℃。图3表明了不同温度对AG对FA吸附的影响结果。由图3可知，当温度<50 ℃时，吸附量随着温度变化趋势不明显，呈现先增大后减小再增大的趋势，吸附量都在125.60 μg/mg(40 ℃)左右。KAMMERER等[13]也报道了类似的趋势，他们认为温度(25、50 ℃)并没有显著影响颜料的结合能力。随着温度继续升高，对FA的吸附量显著降低，60 ℃时的吸附量为80.12 μg/mg。鉴于以上情况，最终选取40 ℃ 进行下一步实验。

图3 不同温度对吸附量的影响Fig.3 Effect of temperature on the adsorption capacity of FA on AG

2.1.4 FA浓度对吸附量的影响

吸附质浓度对吸附过程影响很大，通常都用作影响吸附量的重要因素之一[14]。由图4可知，当温度和缓冲液pH保持不变时，随着FA浓度的增大，吸附量增加。低质量浓度(<5 mg/mL)时吸附量增加幅度较小，高质量浓度(>5 mg/mL)时吸附量陡增，当FA质量浓度增加到17 mg/mL时，吸附量达到极大值，且此时再增大FA浓度，透析时则容易出现结晶现象。结果表明FA浓度显著影响AG吸附FA的效果。

图4 FA浓度对吸附量的影响Fig.4 Effect of the concentration of FA on the adsorption capacity of FA on AG

2.2 响应面优化分析

以吸附量为响应值(Y)，采用Design-Expert 8.0 软件进行响应面回归拟合分析，得到如表2所示的Box-Behnken试验设计方案。拟合得到的理化因素与吸附量间的模型公式为：

式中:X1、X2和X3分别为FA质量浓度(mg/mL)、缓冲液pH和温度(℃)。

表2 Box-Behnken试验设计结果Table 2 The results of central composite design

对响应面模型进行方差分析，结果见表3，模型达到显著水平(P<0.05)，失拟项不显著(P>0.05)，失拟值和纯误差值小，R2=0.913 3，说明方程与实际情况拟合得较好，实验误差小，因此可以用该方程代替实验真实点对实验结果进行分析。方差分析还表明，一次项中有显著影响因素，而二次项所有因素影响都不显著，表明各个试验因素对响应值的影响是简单的线性关系。其中FA浓度和温度对吸附量有极显著的影响，而pH对其影响则并不明显。根据方差分析表中单因素的F值可看出，影响AG吸附FA的因素影响效果按大小排序依次为FA质量浓度(X1)>温度(X3)>pH(X2)。

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance

a-FA质量浓度 (X1)和pH(X2)及其相互作用；b-温度(X3)和FA质量浓度(X1)及其相互作用；c-温度(X3)和pH(X2)及其相互作用图5 FA浓度、pH、温度及其相互作用对AG对FA的吸附能力影响Fig.5 The infuence of FA concentration，pH，temperature and their Interaction

图5-a、图5-b、图5-c分别表示FA质量浓度、pH和温度及其相互作用对AG对FA的吸附能力影响的响应面。可以看出FA浓度、pH和温度间的交互作用不显著，其中FA浓度对吸附量的影响最为显著。根据Design Expert 8.0软件最终拟合出的最优吸附条件为FA质量浓度15 mg/mL，pH 5.03，温度20 ℃，计算出的理论吸附量是1 374.25 μg/mg。在优化后工艺的条件下进行3次验证实验，得到实际吸附量为1 370.17 μg/mg，与模型理论预测值较为接近，说明预测模型比较可靠。

2.3 样品结构表征

2.3.1 紫外图谱分析

由图6可知，FA溶液的图谱中有3个大的吸收峰，215.5 nm(λ1，芳香环的双键吸收，π-π* 跃迁产生)，289.5 nm和312 nm(λ2，λ3含n电子的不饱和基团的吸收，n-π* 跃迁产生)[15]，但是与复合物的图谱对比，复合物的这几个吸收峰都没有，虽然AG和复合物在190～350 nm处没有明显的吸收峰，但是它们浓度相同时吸光度不同，复合物与物理混合物的图谱也明显不同，所以初步判断AG与FA形成了复合物。

a-FA;b-物理混合物;c-AG;d-复合物图6 紫外光谱图Fig.6 Ultraviolet spectrogram of samples注：λ1=215.5 nm, λ2 =289.5 nm, λ3=312 nm

2.3.2 傅里叶变换红外光谱分析

如图7所示，AG在3 400 cm-1左右的宽峰是O—H的伸缩振动，是多糖的特征吸收峰[16]，2 924 cm-1处的峰是—CH2的对称伸缩振动峰。图7中的c为FA的FT-IR图谱，与黄自知等[17]的报道完全吻合。比较图7的b和d可见，AG、FA的化学复合物与其物理混合物的FT-IR图谱有明显差异。图7中的d中物理混合物的图谱保留了FA的特征吸收峰，而图7中的b中复合物的很多FA的特征吸收峰消失，推测是由于AG对FA的非共价吸附作用所致。类似的结果在ZHANG等[5]关于菜籽果胶类多糖与阿魏酸非共价相互作用的研究中有报道。

a-AG;b-复合物;c-FA;d- 物理混合物图7 红外光谱图Fig.7 FT-IR spectrogram of samples

2.4 扫描电子显微镜结果分析

由图8明显可以看出未结合FA的AG颗粒表面比较光滑且体积较大，物理混合物中FA晶体与AG呈分离状态，FA与AG之间未结合；而AG与FA复合物表面粗糙，FA晶体嵌入AG内，结合比较紧密，未见有游离状态的FA晶体,且复合物的颗粒较结合之前的AG小，表明AG与FA结合形成了新物质，形貌特征发生了变化。

a-AG(放大500倍);b-AG(放大2 000倍);c-复合物(放大500倍);d-复合物(放大2 000倍);e-物理混合物(放大500倍);f-物理混合物(放大2 000倍)图8 样品的扫描电子显微镜图Fig.8 Scanning electron microscope of samples

3 结论

(1)通过平衡透析实验对影响AG吸附FA效果在单因素实验的基础上进行Box-Benhnken 设计并进行响应面分析，得到各因素对吸附影响效果的大小顺序为FA质量浓度>pH>温度，优化出AG吸附FA的条件：FA质量浓度15 mg/mL、pH 5.03、温度20 ℃。在此条件下，AG吸附FA的实际值为1 370.17 μg/mg。

(2)紫外和红外扫描图表明AG与FA产生了结合作用，生成了新的复合物。扫描电子显微镜扫描图显示，与各单体、物理混合物相比，AG-FA的形貌特征发生了改变。

(3)本研究证实AG与FA结合产生了新物质，但两者之间结合的分子间作用力，复合物的高级结构和溶液性质还需进一步研究。