菖蒲-远志药对组分对Aβ1-42诱导PC12细胞凋亡和钙离子浓度的影响

孙灵芝，艾 邸

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，主要发生于老年人群，是老年痴呆最常见的一种类型，其主要临床表现为认知功能障碍，如记忆力减退、失语、失认、视空间功能障碍等[1]。AD 的主要病理特征是脑组织神经元细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)聚集形成神经炎性斑(老年斑)和脑组织神经元细胞内高度磷酸化的tau蛋白聚集导致神经原纤维缠结形成[2-4]。随着人口老龄化进程的加剧，AD的发病率也呈逐年上升趋势[5]。Yuan等[6]认为细胞凋亡是引起AD病人海马神经元衰减的重要机制之一，且Aβ诱导的神经元凋亡是AD主要凋亡途径[7-8]。目前，临床上缺乏有效逆转或者终止AD进展的药物。AD属于中医学“痴呆”“呆病”范畴。“痴呆”病名首见于明·张介宾《景岳全书·杂症谟·癫狂痴呆》，在治疗上提出“甚者宜滚痰丸”，肯定了化痰法在痴呆治疗中的重要地位。清·陈士铎《辨证录·呆病门》提出了“呆病”病名，并分析指出“呆病之成，必有其因，大约其始也，起于肝气之郁；其终也，由于胃气之衰。肝郁则木克土，而痰不能化，胃衰则土制水，而痰不能消，于是痰积于胸中，盘据于心外，使神明不清，而成呆病矣”，“治其胃气，则祛其痰涎，则呆病可愈也”。并在所著《石室秘录》中提出“治呆无奇法，治痰即治呆”。明确提出了痰在呆病形成过程中的重要作用，并强调了胃气在痰形成和转归中起着关键性的作用。

经过长期的实验研究和临床实践，中药单体及其有效成分的治疗效果已得到充分的肯定，且具有安全性高和副作用少的优势，因此，其对AD的干预机制也愈加受到关注与重视。中药的成分及作用机制较复杂，研究相对欠缺，而中药单体的成分较单一而具体，其研究较多而深入。近年来，越来越多的学者致力于中药单体及其有效成分干预AD发病机制的研究。本研究提出“水亏火旺，痰迷神窍”为AD的主要病机及“泻火补水，化痰开窍”法治疗痴呆病的理论观点，探讨中药单体石菖蒲-远志药对组分对Aβ诱导的AD细胞模型PC12细胞凋亡和钙离子浓度的干预作用，以进一步明确其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.2 实验试剂 DMEM/HIGH GLOCOSE培养基，phosphate Buffered Saline，Hi Horse Serum，胎牛血清，Aβ1-42，胰蛋白酶(0.25%)-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，AnnexinⅤ/PI试剂盒，fluo3/am试剂盒。

1.3 主要仪器 CO2细胞培养箱，超净工作台，高速离心机，低温离心机，流式细胞仪，ND-1000分光光度计，荧光倒置显微镜，超低温冰箱，移液器。

1.4 方法

1.4.1 PC12细胞培养 超净台内将PC12细胞培养瓶中的原培养液吸出，加入适量0.25%胰酶消化1 min，加入完全培养液终止消化，重悬，将细胞悬液转移至10 mL离心管中。950 r/min离心5 min，倒掉上清液，加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬细胞，重复离心步骤。以5%胎牛血清、5%马血清、90%DMEM的完全培养液重悬细胞，按1∶3比例细胞传代，37 ℃，5%CO2条件下培养，待细胞长满后以3×105/孔密度接种于24孔板上。

1.4.2 分组及干预方法 实验分为α-细辛醚组、远志皂苷组、α-细辛醚联合远志皂苷组、空白对照组。α-细辛醚组加入α-细辛醚标准品，终浓度为20 μmol/L；远志皂苷组加入远志皂苷，终浓度为 100 μmol/L；α-细辛醚联合远志皂苷组加入α-细辛醚标准品终浓度为 10 μmol/L、远志皂苷终浓度为 50 μmol/L。PC12细胞复苏后接种于100 U/mL 青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM完全培养基中，置于 37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。2～3 d 传代 1 次。分别用不同浓度的β-细辛醚、远志皂苷及β-细辛醚+远志皂苷将细胞预处理0 h、3 h、6 h、12 h，然后与不同浓度的Aβ1-42共孵育24 h。

1.4.3 细胞凋亡率检测 采用Annexin Ⅴ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。收集细胞，PBS洗涤2遍，1×binding buffer重悬细胞，调整细胞密度至1×106/mL；取100 μL细胞悬液，加5 μL PI，5 μL异硫氰酸荧光素(FITC)，重悬细胞，25 ℃避光孵育20 min；950 r/min离心5 min，加入1 mL binding buffer重悬细胞；上机检测，以AnnexinⅤ+/PI-记为凋亡细胞。

1.4.4 细胞钙离子浓度测定 采用细胞流式术和钙离子荧光探针fluo3/am检测细胞内钙离子浓度。收集细胞，D-Hanks液洗涤1遍，调整细胞浓度至1×106/mL，每250 μL细胞悬液加入250 μL含有10 μmol Fluo3/am的D-Hanks液，37 ℃孵育45 min，孵育结束后用D-Hanks洗涤2遍，制备1 mL细胞悬液，上机检测。激发波长488 nm，发射波长519 nm。

2 结 果

2.1 菖蒲-远志药对组分对Aβ1-42诱导PC12细胞凋亡的影响 与空白对照组比较，各药物干预组PC12细胞凋亡率均明显降低(P<0.01)；α-细辛醚组凋亡率低于远志皂苷组(P<0.05)；α-细辛醚联合远志皂苷组凋亡率低于α-细辛醚组(P<0.05)。详见图1、图2。结果显示，菖蒲组分抗凋亡作用优于远志组分，二者协同有显著增效作用。

图1 流式细胞术检测细胞凋亡

与空白对照组比较，＊P<0.05；与α-细辛醚组比较，#P<0.05。

2.2 菖蒲-远志药对组分对Aβ1-42诱导PC12细胞钙离子浓度的影响 与空白对照组比较，各药物干预组PC12细胞钙离子浓度均降低(P<0.01)；与远志皂苷组相比，α-细辛醚组钙离子浓度降低(P<0.05)；与α-细辛醚组相比，α-细辛醚联合远志皂苷组钙离子浓度显著降低(P<0.05)。详见图3、图4。结果显示，菖蒲组分抗凋亡作用优于远志组分，菖蒲、远志组分联用有显著增效作用。

图3 荧光探针法检测钙离子荧光强度

与空白对照组比较，＊P<0.05；与α-细辛醚组比较，#P<0.05。

3 讨 论

Aβ诱导的神经元凋亡是AD的重要发病机制之一[7-8]，钙离子在细胞凋亡事件中起重要作用。一方面，随着N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)通道开放导致钙离子内流，钙离子结合钙调蛋白(CaM)后连接一氧化氮合酶(NOS)的还原酶区和氧化酶区，激活NOS生成一氧化氮(NO)[9]；另一方面，在海马神经元中，NOS通过PSD95蛋白与NMDAR锚定在一起，提高了兴奋性氨基酸信号激活NOS的效率[10]。NO可诱导线粒体膜电位减低或上调Bax和Bcl-XL蛋白，引导线粒体内细胞色素C(Cyt-C)的释放，启动Caspase细胞凋亡信号通路[11]。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)正常情况下位于细胞膜内侧，当细胞处于早期凋亡时可转移至细胞膜外侧，AnnexinⅤ是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能与PS特异性结合，通过细胞流式术可检测荧光素标记的AnnexinⅤ。PI能够穿过凋亡细胞的细胞膜，使细胞核红染。将AnnexinⅤ与PI结合起来可以区分早期凋亡和坏死的细胞。fluo3/am是一种检测细胞内钙离子荧光探针，当穿过细胞膜与细胞内钙离子结合时，荧光强度可提高70～80倍，其平均荧光强度可代表钙离子浓度水平。本研究通过AnnexinⅤ/PI双染法和fluo3/am荧光探针检测PC12细胞凋亡和钙离子浓度，探讨菖蒲-远志药对组分抗凋亡的作用机制。

关于痴呆的发病机制历代医家均有论述。元·危亦林《世医得效方·健忘》较早提出“健忘失事、言语如痴”是由“痰迷心包”导致；朱丹溪深入论述了痰浊致病理论，“百病中多有兼痰者，世所不知也”，“痰之为物，随气升降，无处不到”。傅青主在《傅青主男科·癫狂门》中进一步提出中焦脾胃为生痰之源：“饮食入胃，不变精血，反去生痰，痰迷心窍，反生癫狂”。肾气肾阳亏虚，津液失于蒸化而酿生痰浊。关于肾脏与痰的形成的关系，明代医家赵献可在《医贯·痰论》中指出：“肾虚不能制水，则水不归源，如水逆行，洪水泛滥而为痰。”王伦亦进一步阐述了先天肾气和后天脾胃与痰的关系：“痰之本，水也，原于肾。痰之动湿也，主于脾。”

菖蒲、远志是在古方和现代医学中用于治疗痴呆的常用药物。《神农本草经》记载石菖蒲味辛，气温，可“开心孔，补五脏，通九窍，明耳目，出声音。久服轻身，不忘，不迷惑，延年”。叶天士《本草经解》指出“菖蒲辛温为阳，阳主开发，故开心窍”。久服则“不忘不迷惑，阳气充而神明也”；黄元御在《玉楸药解》中指出，“菖蒲辛烈疏通，开隧窍瘀阻，除神志迷塞”。《神农本草经》记载远志“味苦，温。主咳逆，伤中，补不足，除邪气，利九窍，益智慧，耳目聪明，不忘，强志倍力”。李时珍《本草纲目》云：“远志入足少阴肾经，非心经药也。其功专于强志益精，治善忘。盖精与志，皆肾经之所藏也。肾精不足，则志气衰，不能上通于心，故迷惑善忘。”

黄元御在《玉楸药解》中指出，远志“味辛，微温，入手少阴心、足少阴肾经。开心利窍，益智安神”。“辛散开通，治心窍开塞……补肾壮阳，敛精止泻”。李中梓在《雷公炮制药性论》论述远志“味苦，性温，无毒，入心肾二经。补不足，除邪气，益智慧，明耳目，宁怔忡，定惊悸，利九窍，治健忘，壮阳道，益精气，长肌肉，助筋骨”。而叶天士在《本草经解》中论及：“气温益阳，阳主开发，故利九窍……味苦清心，心气光明，故益智慧。心为君主，神明出焉，天君明朗，则五官皆慧，故耳目聪明不忘也。心之所之谓之志，心灵所以志强”。上述医家均明确指出远志苦入心经，温能滋肾，益智作用主要与温肾阳和清心火功效有关。凌一揆主编的《中药学》将远志功效和适应证概括为“宁心安神，祛痰开窍”，适用于健忘及痰阻心窍所致的精神错乱、神志恍惚等，与现代医学老年性痴呆、血管性痴呆的智能下降、精神症状相吻合。石菖蒲主要归心、胃经，偏于辛散，温胃化湿，以绝后天生痰之源；远志主要入心、肾二经，偏于苦降，温肾祛痰，以固先天肾阳之本，又可清降心火，二者相须为用，共奏化痰开窍、益智安神之效。菖蒲、远志合用可见于医家医书，《圣济总录》将二药组方名曰远志汤，用于治疗久心痛；《备急千金要方》和《医心方》中均载有开心散，在远志汤基础上再加人参、茯苓，用于治疗健忘；伍以龟板、龙骨，名曰“孔圣枕中丹”，用于治疗失眠、健忘、神志恍惚。张慧等[12]用高效液相色谱法(HPLC)技术对药对石菖蒲、远志共煎物及单味药水煎物进行了对比分析，结果发现，α-细辛醚和细叶远志皂苷在共煎物中的含量高于单味药水煎物；结合物呈现出与单体成分的显著差异，且在水中的溶解性明显优于单体成分。得出石菖蒲、远志共煎煮过程引起α-细辛醚和细叶远志皂苷产生了理化性质改变，促进了有效成分的煎出。本研究发现石菖蒲提取物(α-细辛醚)和远志提取物(远志皂苷)对AD细胞模型PC12细胞凋亡和钙离子浓度均有抑制作用，且石菖蒲提取物(α-细辛醚)优于远志提取物(远志皂苷)，二者合用有显著的增效作用。

基于历代医家论述及临床观察，本研究提出“泻火补水，化痰开窍”治疗AD理论，探讨了菖蒲-远志药对组分对Aβ1-42诱导PC12细胞凋亡和钙离子浓度的影响，发现石菖蒲提取物(α-细辛醚)和远志提取物(远志皂苷)均可抑制AD细胞模型PC12细胞凋亡和钙离子浓度，且菖蒲-远志药对组分合用具有显著的增效作用。