补阳还五汤对舒张性心力衰竭大鼠心肌钙转运蛋白表达水平的影响

李洁白，沈晓旭

心力衰竭(heart failure，HF)是多种心血管疾病的严重和终末阶段，也是全球心血管领域的重大挑战之一，其中舒张性心力衰竭(DHF)病人占总数的50%以上，为心力衰竭的主要类型，而且随着人口老龄化和人类疾病谱的演化，这个趋势还在进一步加剧[1]。尽管目前对DHF的预防及治疗有了重要进展，但治疗仅涵盖了病理生理途径的一部分，其发病率和死亡率仍居高不下，且不能阻止DHF向慢性终末期进展的趋势。有专家认为心力衰竭的本质原因之一是心肌在收缩舒张时能量供应不足或心肌的能量代谢紊乱，造成心肌的结构和代谢功能受损的一种病理状态，多是由于心脏超负荷工作引起的，因此，衰竭的心脏又被比喻为“没有燃料的引擎”[2]。心肌能量代谢紊乱及能量的缺失已受到越来越多的关注，而Ca2+的释放和摄取在心肌细胞能量代谢中起关键作用，所以对心肌细胞内Ca2+的循环进行干预可能成为治疗DHF的切入点。因此，本实验采用腹主动脉缩窄法建立DHF大鼠模型，并运用补阳还五汤给予中药干预，利用聚合酶链式反应法(PCR)技术检测L型钙通道(LTCC)、兰碱尼受体(RyR2)、肌浆网上的钙泵(SERCA2a)和受磷蛋白(PLB)的mRNA转录表达量，探索补阳还五汤对DHF的干预效应和可能的药物作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康SD大鼠60只，体重(190±10)g，无特定病原体(SPF)级，购自北京维通利华生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。所有实验大鼠均饲养于北京中医药大学东直门医院重点学科实验室，屏障级动物房[动物房编号：SYXK(京)2015-0001]，无菌饲料专人喂养，恒温恒湿，温度22～24 ℃，相对湿度50%。

1.2 药物 酒石酸美托洛尔片(阿斯利康制药有限公司，批号：国药准字H32025391)；补阳还五汤按照《医林改错》所载的药味用量进行制备，处方：生黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍4.5 g，地龙3 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g。所有中药均购自北京同仁堂科技发展有限公司。

1.3 试剂及仪器 超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)、DNase 1、5x RNA Loading Buffer(CWbio.Co.Ltd，批号：Cat.NoCW0581、Cat.NoCW0744、Cat.NoCW0956、Cat.NoCW2090、Cat.NoCW0611A)；超高分辨率小动物彩色多普勒超声实时影像系统(加拿大VisualSonics公司，型号：vevo770)，涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-902)，离心机(艾本德有限公司，型号：Centrifuge 5415D)，分光光度计(赛默飞世尔科技公司，型号：NANODROP 2000)，荧光定量PCR仪(杭州博日科技有限公司，型号：Line Gene 9600 Plus)，-80 ℃冰箱(赛默飞世尔科技公司，型号：900SERIES)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及造模 60只大鼠在动物房正常饲养3 d后，将大鼠分为假手术组和造模组，其中假手术组15只大鼠，造模组45只大鼠。造模组参照文献[3-4]采用腹主动脉缩窄法制成DHF模型。具体步骤如下：大鼠术前12 h禁食不禁水，用水合氯醛溶液麻醉(0.33 mL/100 g)后，将大鼠仰卧固定于手术台上，于大鼠剑突下2～3 cm，沿腹中线切开4～5 cm切口，拉开切口，用手轻轻翻出肠管等内脏置于生理盐水湿润的无菌纱布上，找到大鼠的左肾动脉，剥离腹后膜，在肾动脉分支处找到腹主动脉，在肾动脉上方0.2 cm处用4号手术线将腹主动脉与平行放置的7号针头一起结扎，结扎后抽出针头达到狭窄目的。关闭腹腔前将青霉素适量滴入腹腔防止术后腹部感染，回纳肠管。逐层缝合切口，术后消毒伤口。假手术组大鼠不结扎腹主动脉，其余操作同模型组。术后将大鼠仰卧放回单笼饲养并给予保温直到苏醒。苏醒后，每只大鼠给予4×105U青霉素腹腔注射，连续注射3 d。在本实验中，造模后共死亡8只大鼠，其中造模组6只，假手术组2只，剩余52只进入后续的实验。

造模后饲养10周，整个实验过程中观察大鼠的存活率及体重、进食、皮毛变化、精神状态、活动情况等一般情况。10周后，利用超声心动图检测大鼠左室射血分数(LVEF)和二尖瓣环舒张早期运动速度/二尖瓣环舒张晚期运动速度(e′/a′)比值，将LVEF>45%及e′/a′<1.2作为DHF模型成功的标准。经检测造模成功的大鼠共33只，将造模成功的大鼠运用随机区组法分为模型组(11只)、西药组(11只)和中药组(11只)。

1.4.2 药物制备 中药煎煮、过滤后浓缩，直至药液浓度为2.5 g/mL时停止，分装。酒石酸美托洛尔片剂碾碎溶解于去离子水中，制成悬溶液，药液浓度为0.000 5 g/mL，将所有药物放于4 ℃冰箱中保存待用。

1.4.3 给药方法 临床治疗70 kg体重的病人，每日服补阳还五汤按生药量计为142.5 g，根据成人临床用药剂量及大鼠换算系数折算。具体剂量为，中药组应用补阳还五汤12.72 g/(kg·d)灌胃，西药组应用酒石酸美托洛尔0.004 5 g/(kg·d)灌胃，假手术组、模型组给予等量的去离子水灌胃。各组均每日灌胃1次，共给药干预8周，给药期间各组大鼠自由进食、进水，并持续观察大鼠的一般状态。

1.4.4 各组大鼠心肌钙转运蛋白mRNA转录水平检测 为保证各指标检测一致性，每组选取7只大鼠进行检测，大鼠称体重后麻醉，开胸取心脏，分离心底部大血管、心房及右心室，留取左心室部分，置于预冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干，-80 ℃冰箱中保存，以备PCR检测。检测步骤如下：①用超纯RNA提取试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取组织样本中总RNA，取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性；②利用Premier 7.0软件，依据实时定量引物设计原则设计引物(见表1)；③用第一链合成试剂盒进行反转录，将RNA模板、引物、5xRT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上备用，65 ℃孵育5 min，迅速冰浴2 min，短暂离心，继续加入其他试剂，轻轻吸打混匀，37 ℃孵育50 min，70 ℃保温10 min，反应结束后的cDNA放置-20 ℃保存；④进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)，用UltraSYBR Mixture(With ROX)进行扩增，扩增程序为：95 ℃、10 min(95 ℃、15 s，60 ℃、60 s)×45个循环，将各样品cDNA 10倍稀释后取2 μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60～95 ℃进行溶解曲线分析。反应结束后进行结果分析。选取15～25个扩增循环数(Ct)的荧光值，计算3个平复孔的扩增效率，△Ct=Ct(实验组目的基因)-Ct(对照组目的基因)，△△Ct=[Ct(实验组目的基因)-Ct(实验组内参基因)]-[Ct(对照组目的基因)-Ct(对照组内参基因)]，计算实验组目的基因与对照组目的基因的差异表达量，2-△△Ct=实验组目的基因/对照组目的基因。

表1 RT-PCR检测目的基因引物

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 大鼠手术后等待成模的10周内，模型组死亡2只，分析其原因可能是结扎过度导致大鼠发生心力衰竭、肺水肿、肺淤血而死亡。行缩窄术后10周，造模组大鼠有反应迟钝、毛发枯黄无光泽、进食饮水减少等症状，给药4周及8周时观察大鼠的一般状况，除模型组外，其余各组精神、饮食逐渐好转，毛发恢复正常。

2.2 各组大鼠心肌钙转运蛋白LTCC、RyR2、SERCA2a与PLB的mRNA表达情况 各组LTCC的△Ct比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组相比，模型组、中药组RyR2△Ct均升高(P<0.05)，而西药组RyR2△Ct与假手术组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组相比，模型组、中药组、西药组SERCA2a、PLB的△Ct均升高(P<0.05)；与模型组相比，西药组、中药组SERCA2a、PLB的△Ct均降低(P<0.05)；中药组与西药组SERCA2a、PLB的△Ct相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。根据RT-PCR原始检测结果，按照2-△△Ct相对定量计算公式，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品目的基因mRNA转录水平的差异。详见表3。在以上结果的基础上分析表3，可知模型组、中药组RyR2的蛋白基因表达量较假手术组降低。SERCA2a和 PLB的基因表达有所变化，其中模型组与假手术组相比基因表达量均下降，而中药组、西药组的基因表达量较模型组上升。

表2 各组大鼠LTCC、RyR2、SERCA2a与PLB的△Ct结果比较 (±s)

表3 各组钙转运调节蛋白基因相对表达量比较

3 讨 论

古代的中医学没有舒张性心力衰竭这一病名的记载，但查阅相关资料发现有与此类似的一些证候和症状出现，现多认为DHF属于中医学的“心痹”“心悸”“怔忡”“喘证”等病症范围内。从中医的观点来看，DHF的病变部位主要在心，同时肺、脾、肾等多个脏器受累，《黄帝内经》中最早讨论了引起心衰病的病因病机，《素问》曰：“劳则喘息汗出，外内皆越，故气耗矣”。说明大量的体力劳动会损伤人体中的气，造成正气虚衰无力运行血脉，即血不能顺利到达全身各处，引起心衰；《圣济总录》中也提出心气虚是引起心衰病的基本病机之一。《素问》中还明确提出了饮食因素，如过食咸而伤肾，过食甘而伤脾，脾肾虚弱，则气血生化无源，气虚血少不能濡养心脉终成心衰病。后世医家在前人的基础上，结合多年临床经验总结归纳，提出了一些对DHF的病因病机的新见解。现代医家多认为本病为本虚标实之证，本虚为阳气亏虚，标实为血瘀、痰饮、水停等邪实停聚，可见虚实夹杂是心衰病的特点。

目前，对于DHF病证分型的研究较少，还没有统一的DHF辨证分型标准。对DHF的证素研究发现其首要发病基础为气虚，心气虚应为DHF的最初原因，并将跟随DHF的整个病程[5]。中医学理论认为“气为血之帅，血为气之母，气行则血行，气虚则血瘀”，气虚无法推动血液在脉道中的运行，则血行缓慢，血流不畅，壅滞于经络脏腑之中，加上血失统摄等因素，终致血瘀内停。本课题组在总结临床经验并结合前期研究的基础上，发现气虚血瘀为DHF的主要证候特点，其中气虚为本，因虚导致邪实的产生，转变为虚实交杂的气虚血瘀证。正常生理状况下心肌细胞一个完整的收缩和舒张过程伴随着细胞内钙的循环流动，包括肌浆网中的钙释放、钙摄取和钙储存3部分，如果其中任何环节受到损害都会使心肌细胞的钙平衡状态受到影响，导致心肌的收缩舒张功能异常。其中心肌舒张过程包括Ca2+被重摄取回肌浆网、PLB的磷酸化等需要能量的过程，因此，心肌从收缩到弛缓的转变需要大量的能量供应。而中医所说的“气”与现代生物学的“能量”在一定程度上有相通性，能量代谢紊乱可能是气虚的本质之一[6]。

本课题组运用益气活血法治疗DHF，选用益气活血法的代表方剂，即清代王清任《医林改错》中的补阳还五汤。全方由大量补气药与少量活血药相配，气旺则血行，活血而又不伤正，功在补气活血、祛瘀通络之功。而Ca2+转运调节蛋白可能成为潜在的药物作用靶点，既往研究也表明益气活血药对心脏舒张收缩功能的改善作用可能与调控、维持心脏心肌细胞的正常钙转运有关[7]。本实验结果表明补阳还五汤可明显提高DHF大鼠SERCA2a和PLB的mRNA转录，而对于LTCC和RyR2则没有明显作用，提示DHF大鼠的发病机制可能与LTCC无关。RyR2主要参与心肌的收缩过程，可能不是补阳还五汤发挥作用的药物靶点。补阳还五汤主要改善DHF大鼠SERCA2a和PLB的mRNA转录，而这两种钙转运蛋白在心肌的舒张过程中发挥重要作用，说明补阳还五汤有可能通过作用于这两种蛋白发挥改善DHF大鼠左室舒张功能的作用。