超声波辅助碱液提取核桃分心木黄酮及其抗氧化活性的研究

沙玉欢，习 俞，朱增芳，吴庆智，毛晓英

（石河子大学食品学院，新疆石河子 832000）

核桃分心木（Diaphragma juglandis Fructus），简称分心木，又名核桃内隔膜，是胡桃科核桃属植物果核内部的木质隔膜，呈弯曲的薄片状，且质地脆，一般是核桃总质量的5%左右，是新疆传统维吾尔族药物之一，具有利尿清热、健脾固肾、涩精等作用[1]。现在的人们通常会将分心木用水煮沸后饮用，治疗肾虚、遗精等。长期喝分心木水泡物，还可以缓解老年人的腰酸腿疼，改善睡眠质量，提高身体免疫力[2-3]。核桃分心木中含有丰富的活性成分，包括有机酸、酚类、黄酮、生物碱、油脂、皂苷、挥发油、糖类、氨基酸、鞣质、多肽和其他化合物[4-5]。

大量研究结果表明分心木中有大量的黄酮类物质[1，4]。黄酮类物质又称为类黄酮物质，是以α -苯基苯并吡喃酮为主体的一系列物质的总称，在治疗疾病和食品添加剂方面的应用较为广泛。它不仅可以清除人体内的游离自由基，还可抑制各种自由基的产生，起到延缓衰老、预防心脑血管疾病和癌症等作用[6-7]。目前黄酮的提取方法主要有有机溶剂提取法[8]、微波辅助提取法[9]、碱提酸沉法[10]、超声波辅助提取法[11]、超临界提取方法[7]等。其中碱液提取核桃分心木黄酮具有安全、方便的特点，然而传统的碱液提取分心木中黄酮得率较低，因此利用碱溶液在超声波辅助下提取核桃分心木中总黄酮类物质，先进行单因素试验，在此基础上通过响应面[10-11]优化获得最佳工艺参数[12]，并对粗提物抗氧化能力进行初步探索，为核桃分心木黄酮的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

核桃分心木，购于石河子农贸市场；芦丁标准品，北京索莱宝科技有限公司提供；无水乙醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、FeSO4、邻菲啰啉、DPPH、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、盐酸、菲洛嗪、FeCl2，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

XB-220A 型普利赛斯电子天平，普利赛斯国际贸易（上海） 有限责任公司产品；752 型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；DK-8D 型数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司产品；Heraeus Multifuge X1R 型台式冷冻离心机，赛默飞世尔科技（中国） 有限公司产品；DFT-100 型手提式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司产品；KQ-200VDE 型双频数控超声波清洗机、标准分析筛，新乡市雷蒙特机械有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 分心木的预处理

将分心木置于烘箱中45 ℃条件下干燥12 h，用DFT-100 型粉碎机粉碎，并用80 目筛过筛，置于密封袋中备用。

1.3.2 标准曲线的制备

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13]获得标准曲线。具体方法：准确称量10 mg 芦丁标准品于50 mL 容量瓶，用60%乙醇定容，得到质量浓度为0.20 mg/mL芦丁标准液。向10 mL 容量瓶中分别吸取芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，得到质量浓度分别为0，0.01，0.02，0.03，004，0.05 mg/mL 的芦丁标准溶液。分别加入0.3 mL NaNO2溶液（质量分数为5%），室温下反应6 min，再加入0.3 mL Al(NO3)3溶液（10%），继续反应6 min，最后加入4 mL NaOH 溶液（4%），用30% 乙醇定容，室温下等待15 min，摇匀，测定波长507 nm 处吸光度。以吸光度（A） 为纵坐标，芦丁溶液质量浓度（C） 为横坐标，绘制芦丁溶液的标准曲线。

1.3.3 分心木总黄酮的测定

提取液于50 mL 容量瓶中以50%乙醇定容。分别取样品液0.1 mL，按照1.3.2 方法进行反应。于波长507 nm 处测吸光度。由标准曲线的拟合方程得到黄酮物质的质量浓度。黄酮得率计算公式如下：

式中：C ——提取液中黄酮质量浓度，mg/mL；

V1——样品提取液定容体积，mL；

V2——测量时量取提取液的定容总体积，mL；

V3——测定用的样液体积，mL；

m——分心木质量，g。

1.3.4 单因素试验

（1） 碱液浓度的选择。准确称取1 g 样品于50 mL离心管中，在料液比1∶30，超声提取1 h，超声频率140 Hz 的条件下，碱液浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L 时，研究碱液浓度对分心木黄酮得率的影响。

（2） 料液比的选择。准确称取1 g 样品与50 mL离心管中，在提取温度45 ℃，超声频率140 Hz，碱液浓度0.3 mol/L，超声提取1 h 条件下，料液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 时，研究料液比对分心木黄酮得率的影响。

（3） 超声时间的选择。准确称取1 g 样品与50 mL离心管中，在料液比1∶30，提取温度45 ℃，碱液浓度0.3 mol/L，超声频率140 Hz 下，超声提取时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h 时，研究超声时间对分心木黄酮得率的影响。

（4） 超声功率的选择。准确称取1 g 样品与50 mL离心管中，在料液比为1∶30，碱液浓度0.3 mol/L，提取温度45 ℃，超声提取1 h 条件下，超声频率分别为120，140，160，180，200 Hz 时，研究超声功率对分心木黄酮得率的影响。

1.3.5 响应面优化

在单因素试验结果的基础上，运用Design Expert 8.0.6 设计响应面试验，分析了各因素之间的交互作用及对核桃分心木总黄酮得率的影响大小。对超声功率、料液比、超声时间进行三因素三水平的试验设计。以黄酮得率为响应值，获得最佳提取工艺及参数。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

1.4 抗氧化能力的测定

1.4.1 粗提物样品预处理

粗提物称取0.1 g 用20%乙醇溶液溶解并用滤纸过滤，于100 mL 容量瓶定容，配置成质量浓度为1 mg/mL 溶液，并将样品稀释200 倍进行抗氧化能力测定，粗黄酮纯度为2.776%。

1.4.2 DPPH 自由基清除能力的测定

参照Cheng Z 等人[14]的方法，略有改动。以维C为阳性对照。DPPH 用无水乙醇超声溶解，配置成一定质量浓度（波长517 nm 处吸光度为0.4～0.8）。4 mL DPPH 溶液中加入4 mL 样品液的吸光度记为A1，4 mL无水醇溶液中加4 mL 样品液的吸光度记为A2，4 mL DPPH 溶液中加入4 mL 无水乙醇溶液的吸光度记为A。按公式（2） 计算。

式中：C——DPPH 自由基基清除率，%；

1.4.3 羟自由基清除率的测定

采用邻二氮菲-Fe2+法测定羟自由基清除率[15]。向试管中加入0.75 mmol/L 邻菲罗啉和pH 值7.4 的PBS 缓冲液1.5 mL，充分混匀后加入浓度为0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL，再向试管中加入粗提物溶液1 mL混匀置于37 ℃水浴锅中反应30 min，反应结束后于波长536 nm 处测定各管的吸光度[16]记为A1；其中，阴性对照试验用1 mL 蒸馏水代替样品溶液，再加入质量分数为0.01%的过氧化氢溶液反应30 min 测定吸光度记为A0；正常试验用1 mL 的蒸馏水代替过氧化氢溶液，测定吸光度记为A2。样品试验为1 mL样品溶液同质量浓度的维C 作阳性对照。按公式（3） 计算。

1.4.4 超氧阴离子自由基的测定

采用邻苯三酚法[17]测定超氧阴离子自由基清除率。取5 mL pH 值8.2 的磷酸盐缓冲溶液与1 mL 样品溶液混合，室温反应15 min（25 ℃），然后加入45 mmoL/L 的邻苯三酚0.2 mL，摇匀，反应4 min，用一滴10 mol/L 的盐酸终止反应。于波长325 nm 处测定吸光度，记为A1；0.2 mL 的蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定的吸光度记为A2；用1 mL 溶剂代替样品溶液测定吸光度，记为A3，平行3 次，同质量浓度的维C 作阳性对照。按公式（4） 计算。

1.4.5 ABTS 自由基清除能力测定

采用黄尚荣等人[18]的方法，略有改动。配置7 mmol/L ABTS 溶液与2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液，将ABTS 溶液与过硫酸钾溶液按1∶0.5 比例在锥形瓶中混匀，于室温并且避光反应12 h，使其产生ABTS 自由基。使用前将ABTS 自由基溶液用无水乙醇稀释至734 nm 处的吸光度为（0.700±0.020）。取1 mL 样品再加入4 mL 稀释的ABTS 自由基溶液，30 ℃条件下反应6 min 后于波长734 nm 处测定吸光度，记为A1。1 mL 无水乙醇代替样品溶液，吸光度记为A0。重复3 次，同质量浓度的维C 作阳性对照。按公式（5） 计算。

1.4.6 铁离子螯和能力的测定

参考郑义等人[19]的方法进行测定。取1 mL 的样品溶液于10 mL 试管中，加3.7 mL 蒸馏水，再加入2 mmoL/L 的FeCl2溶液0.1 mL 和5 mmoL/L 的菲洛嗪溶液0.2 mL。于25 ℃下水浴10 min，于波长562 nm处测吸光度，A0是以1 mL 的蒸馏水代替样品溶液反应后的吸光度，A1是样品溶液反应后的吸光度，A2是用0.1 mL 的蒸馏水代替FeCl2溶液反应后的吸光度。以同质量浓度的EDTA 作阳性对照。按公式（6） 计算。

1.5 数据处理

采用Origin7.5 绘图，SPSS25.0 进行数据处理及统计分析，Design Expert 8.0.6 软件进行响应面优化及分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的确定

根据标准曲线得到拟合方程为：

芦丁标准曲线见图1。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 碱液浓度的选择

碱液浓度对黄酮得率的影响见图2。

由图2 可知，随着碱液浓度的升高黄酮含量先升高后降低，当碱液浓度达到0.3 mol/L 时，黄酮得率达到最大值。黄酮得率升高的原因可能与黄酮类化合物分子中酚羟基有关，碱溶液增加了溶剂的极性，比较用酸溶液和碱溶液作为溶剂提取黄酮时，碱溶液提取黄酮得率明显比酸溶液高，且随着NaOH溶液浓度的增加，黄酮得率增加，较高的碱液浓度导致黄酮物质的母核破坏。同时，碱溶性杂质也随着温度和碱浓度的升高而溶出，碱溶性杂质与黄酮类物质竞争溶出[20]，从而导致黄酮类物质的得率下降。因此，选择浓度为0.3 mol/L 的稀碱溶液作为浸提溶剂。

2.2.2 料液比的选择

料液比对黄酮得率的影响见图3。

图1 芦丁标准曲线

图2 碱液浓度对黄酮得率的影响

图3 料液比对黄酮得率的影响

由图3 可知，随着料液比的增加黄酮得率不断升高，随着溶剂的增加，溶液与核桃分心木粉末接触面积增加，溶剂与溶质接触充分，黄酮物质源源不断地析出，导致黄酮得率不断升高；当料液比继续增加，黄酮得率虽然有所增加，但不显著，反而大大增加了黄酮物质提取的成本。因此，选择最佳的料液比为1∶30。

2.2.3 超声时间的选择

超声时间对黄酮得率的影响见图4。

由图4 可知，黄酮提取率先急剧升高后得率趋于平缓。原因可能是随着超声时间的增加，温度也会随之升高，减弱溶质和溶液之间的相互作用力，溶质更容易溶解到溶剂中[21]。因此，选择最佳的提取时间为1.5 h。

2.2.4 超声功率的选择

超声功率对黄酮得率的影响见图5。

图4 超声时间对黄酮得率的影响

图5 超声功率对黄酮得率的影响

由图5 可知，随着超声功率的增加黄酮得率先缓慢增加然后急剧下降，这可能由于随着超声功率的增加，温度升高，加快黄酮物质的溶出，另一方面，由于超声波释放能量会产生大量气泡。气泡爆裂使周围组织乳化甚至破裂，这一生物学效应称为“空穴效应”。分心木中的黄酮物质大部分存在于细胞内或者细胞膜表面，随着超声功率的增加“空穴效应”导致界面扩散层上的分子扩散速度加快并且破坏细胞组织，使黄酮加速溶出。而后黄酮得率急剧下降，过高的功率容易导致黄酮物质结构破坏或者导致固体材料中的杂质溶出，从而降低了黄酮得率[22]。因此，最佳超声功率选为140 W。

2.3 响应面结果分析

2.3.1 响应面设计及结果

响应面试验设计方案见表2。

2.3.2 响应面的建立与分析

经多元回归拟合和方差分析，得回归方程：

由表3 分析结果可知，该回归方程p＜0.001，说明该模型极显著，具有统计学意义。同时，由Design Expert 8.0.6 软件可得模型的复相关系数R2=0.943 1，矫正系数R2Adj=0.869 9＞0.8，表明此该模型拟合度良好。因此，可用此模型进行分心木中黄酮得率的分析和预测是合理的。试验结果的预测和分析能用该回归方程来替代真实试验点分析由3 个因素A，B，C 得出的F 值判断，各因素对分心木中黄酮提取的影响顺率序为超声时间＞料液比＞碱液浓度。交互项AB，AC，BC 的p＜0.05，表明碱液浓度和超声时间、碱液浓度和料液比、超声时间和料液比之间有交互作用且对分心木中的黄酮类物质的得率影响显著。

方差分析见表3。

表2 响应面试验设计方案

表3 方差分析

2.3.3 响应面交互作用分析

响应曲面越陡峭，表明2 个因素对总黄酮得率的影响越大，反之，曲面越平缓表明2 个因素对总黄酮得率的影响越小。等高线图呈现椭圆，表明交互性良好。

超声时间与碱液浓度对黄酮得率交互作用的响应面和等高线图见图6。

图6 超声时间与碱液浓度对黄酮得率交互作用的响应面和等高线图

由图6 可知，响应曲面图曲面陡峭，对总黄酮提取率的影响极显著，等高线图呈椭圆，说明超声时间和碱液浓度交互性良好。

料液比和超声时间对黄酮得率交互作用的响应面和等高线图见图7，料液比和碱液浓度对黄酮得率交互作用的响应面和等高线图见图8。

由图7 和图8 可以明显地看到曲面较陡峭，反映出两因素对黄酮的得率的影响显著，交互性良好。另外，3 个响应面图呈现凸状，开口朝下，有最高点，且从最高点向四周边缘均匀下降，这表明各因素作用增大时，响应面值也增大，达到最高点后，各因素作用增大，响应面值反而会减小[23]。

2.3.4 验证试验

利用Design Expert 8.0.6 软件分析得到的回归模型的方程为Y=13.41+0.39A+1.73B+0.59C+2.33AB+2.00AC-1.71BC-1.88A2-2.89B2-0.93C2，得到最佳提取工艺参数为碱液浓度0.39 mol/L，超声时间1.25 h，料液比1∶36.78，最佳提取条件下的分心木中黄酮类物质的预测得率为14.05%。为了验证设计试验结果，也为了操作的简便可行，采取碱液浓度0.4 mol/L，超声时间1.5 h（90 min），料液比1∶37 作为最佳条件，在此基础上做3 次平行试验，可得分心木中黄酮得率均值为13.95%。实际所得的平均得率与预测值差值为0.71%，说明该模型对分心木总黄酮提取工艺条件参数优化是可靠的。

图7 料液比和碱液浓度对黄酮得率交互作用的响应面和等高线图

图8 料液比和超声时间对黄酮得率交互作用的响应面和等高线图

2.4 粗提取物抗氧化能力的研究

抗氧化能力测定结果见表4。

表4 抗氧化能力测定结果/ %

由表4 可知，除了铁离子螯和能力，核桃分心木黄酮粗提物的其他抗氧化指标都高于维C 阳性对照，尤其DPPH 自由基清除率和羟自由基清除率，其中DPPH 自由基清除率高出43.54%，而羟自由基清除率高出50%。碱液提取的粗黄酮物质中可能含有各种多糖物质，还有其他小分子物质和多种黄酮类物质共同作用导致抗氧化能力提高，高于单一组分的维C阳性对照物。结果表明，核桃分心木黄酮具备天然抗氧化剂的应用潜质，黄酮物质与多糖组分或者黄酮物质之间相互作用，导致粗提物抗氧化能力比单一组分的阳性对照物的抗氧化能力高。

3 结论

采用响应面分析软件设计了三因素三水平试验，并进行回归分析得到分心木黄酮得率的最佳提取工艺及参数。最佳参数为碱液浓度0.4 mol/L，超声时间1.5 h，料液比1∶37，得分心木中黄酮得率均值为13.95%±2.163%。由抗氧化能力的测定结果可知，除了铁离子螯和能力粗提物的其他抗氧化指标显著高于维C 阳性对照，尤其DPPH 自由基清除率和羟自由基清除率，其中DPPH 自由基清除率高出43.54%，羟自由基清除率比同等质量浓度的阳性对照物高出50%。原因可能与粗提物中的多糖组分或者几种黄酮类物质之间的相互作用有关，导致抗氧化能力的提高。研究结果表明，核桃分心木是黄酮提取的理想材料，且黄酮粗提物具有很高的抗氧化能力，研究为核桃副产物的精深加工提供一定的理论基础。