芪参益气滴丸对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用及其机制

陈家显 ,刘先霞,陈跃武,陈磊,张远生,陈劲松

（1.海南医学院第二附属医院心血管内科，海南 海口 570311；2.南华大学附属第二医院心血管内科，湖南 衡阳 421001）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一种常见的心血管疾病，也是各种心脏疾病的终末期表现，近年来其发病率呈上升趋势，且因其具有高发病率和高死亡率的特点已引起研究者高度关注［1］。目前CHF 的治疗仍以药物治疗为主，西药控制心力衰竭进展及改善症状有良好的效果，但其局限于对症处理，且药物不良反应明显。中医药治疗心血管疾病已体现出其独特优势，近年来的研究［2-3］表明：中医药治疗心血管疾病疗效确切，安全性高，且具有多靶点、多层次和多环节等优势。芪参益气滴丸（Qishen-Yiqi Dropping Pill，QSYQ）是治疗气虚血瘀型胸痹的中药制剂，主要由黄芪、丹参、三七和降香组成，具有益气活血的功效，临床广泛地应用于冠心病及心力衰竭的治疗，并取得了良好效果［4-5］，但其作用机制尚未明确。本研究通过观察CHF 大鼠心脏超声表现、心肌细胞形态、氧化应激水平及细胞凋亡蛋白的表达，探讨QSYQ 对心力衰竭发生时氧化应激水平和心肌细胞凋亡的影响，阐明其在CHF 发生发展过程中的保护作用及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器无特定病原体（SPF）级雄性SD 大鼠60 只，鼠龄6～7 周，体质量（220±20）g，由湖北省动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2018-0027。大鼠饲养条件：温度24℃，湿度50%，通风良好，明暗光照交替12 h，标准饲料喂养，自由进食及饮水。适应环境1 周，术前禁食24 h，不禁水。QSYQ（批号150906）购于天津天士力制药集团股份有限公司，卡托普利（批号H31022986）购于中美上海施贵宝制药有限公司，苏木素、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒和活性氧（ROS）检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、核因子E2 相关因子2（Nrf2）和血红素氧化酶1（HO-1）抗体购于美国Cell Signaling Technology 公司。ACUSON X300 超声心动图仪购于德国西门子公司，RX50M 正置显微镜和摊片机购于德国徕克显微系统有限公司，UniCel DxC600全自动生化分析仪购于美国Beckman Coulter 公司，Tanon-3500（R）全自动数码凝胶图像分析系统购于上海天能科技有限公司，Varioskan LUX 酶标仪购于美国Thermo Fisher Science 公司。

1.2 实验动物模型制备和分组60 只SPF 级雄性SD 大鼠，适应性饲养1 周后，随机分为假手术组、模型组、阳性药对照组（6.75 mg·kg－1·d－1卡托普利）［6-7］、低剂量（135 mg·kg－1·d－1）QSYQ 组和高剂量（270 mg·kg－1·d－1）QSYQ 组，每组12 只。3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，采用冠状动脉前降支结扎法建立CHF 模型（假手术组不结扎冠状动脉）［8］，造模结束后利用超声心动图仪检测大鼠心功能，左室射血分数（ejection raction，EF）≤50%视为CHF 造模成功［9-10］，术后24 h 灌胃给药，连续4 周，其中假手术组和模型组大鼠每天给予其他3 组等量生理盐水灌胃。

1.3 超声检查各组大鼠灌胃4 周后进行心脏超声检测，记录左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVSD）、左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVDD）、EF 和左室短轴缩短率（left ventricular short-axis shortening rate，FS）。

1.4 TUNEL 法检测大鼠心肌组织细胞凋亡率3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取左室心肌组织，洗净后用10%甲醛固定24 h 后脱水处理，常规石蜡包埋，制作3～4 μm 厚度的石蜡切片，采用脱TUNEL 标记凋亡的细胞核。于200 倍视野计数凋亡细胞数，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5 大鼠血清中LDH和SOD 活性及MDA 水平大鼠腹主动脉取血，4℃条件下3 000 r·min－1离心10 min，取血清。按照试剂盒操作说明书加入相应试剂，孵育后于440 nm 波长处检测各样品吸光度（A）值，根据试剂盒操作说明书提供的计算公式分别计算LDH 和SOD 活性及MDA 水平。

1.6 大鼠心肌组织中ROS 水平检测取大鼠左室心肌组织，在预冷的PBS 缓冲液中漂洗，加入适量胰酶消化液，37℃消化30 min，间断性吹打已消化组织，用预冷PBS 缓冲液终止消化，采用300 目尼龙网过滤，收集细胞，500 r·min－1离心10 min，弃上清，重悬细胞，重悬后按照试剂盒操作说明书步骤进行，加入10 μmol·L－1DCFH-DA 荧光探针避光孵育30 min，PBS 缓冲液洗涤3 次，使用488 nm 激发波长、525 nm 发射波长，采用流式细胞仪检测，以相对平均荧光强度值表示细胞内ROS 水平。

1.7 Western blotting 法检测各组大鼠心肌组织中Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平取大鼠左室心肌组织，称质量后加入预冷的组织蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂匀浆，冰上碾磨组织，4℃条件下12 000×g 离心20 min，收集上清，采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取20 μg 蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，并将蛋白转移至PVDF膜上，5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1 和β-actin 抗体，4℃孵育过夜。次日，加入相应二抗室温孵育1 h，ECL 试剂曝光显影，在全自动凝胶成像系统中曝光显影，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值。

1.8 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠LVSD、LVDD、EF 和FS，心肌细胞凋亡率，血清中LDH 和SOD 活性及ROS 和MDA 水平，心肌组织中cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标与假手术组比较，模型组大鼠LVSD 和LVDD 明显升高（P＜0.05），EF 和FS 明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，高剂量QSYQ 组和阳性药对照组大鼠LVSD 和LVDD 明显降低（P＜0.05），EF 和FS 明显升高（P＜0.05），低剂量QSYQ 组大鼠心功能指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心功能指标Tab.1 Cardiac function indexes of rats in varions groups（n＝12,）

表1 各组大鼠心功能指标Tab.1 Cardiac function indexes of rats in varions groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.2 各组大鼠心肌组织细胞凋亡情况假手术组大鼠心肌组织TUNEL 染色切片中棕黄色细胞不明显，细胞凋亡率为（5.67±0.62）%；模型组大鼠心肌细胞棕黄色细胞明显增多，细胞凋亡率为（39.40±3.07）%，较假手术组明显升高（P＜0.05）；高剂量QSYQ 组和阳性药对照组大鼠心肌组织中棕黄色细胞明显减少，细胞凋亡率分别为（15.65±1.90）%和（9.84±0.88）%，较模型组明显降低（P＜0.05），低剂量QSYQ 组大鼠肌细胞凋亡率与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.3 各组大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平与假手术组比较，模型组大鼠血清中LDH 活性和MDA 及ROS 水平明显升高（P＜0.05），SOD 活性明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，高剂量QSYQ 组和阳性药对照组大鼠血清中LDH 活性及MDA 和ROS 水平明显降低（P＜0.05），SOD 活性明显升高（P＜0.05），低剂量QSYQ 组大鼠血清中上述各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平Tab.2 Activities of LDH and SOD and levels of MDA and ROS in serum of rats in various groups（n＝12,）

表2 各组大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平Tab.2 Activities of LDH and SOD and levels of MDA and ROS in serum of rats in various groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.4 各组大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白表达水平与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，高剂量QSYQ 组和阳性药卡托普利组大鼠心肌组织中Cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），低剂量QSYQ组大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2 和表3。

图2 各组大鼠心肌组织中Cleaved-Caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of leaved-Caspase-3，Bax，and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表3 各组大鼠心肌组织中Cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of Cleaved-Caspase-3,Bax,and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝12,）

表3 各组大鼠心肌组织中Cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of Cleaved-Caspase-3,Bax,and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.5 各组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，高剂量QSYQ 组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），阳性药对照组和低剂量QSYQ 组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3 和表4。

图3 各组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表4 各组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in varions groups（n=12,）

表4 各组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in varions groups（n=12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

3 讨论

CHF 是由于长期心脏负荷过重，心肌损害和收缩力减弱所致的心功能不全的一种综合征，也是众多心脏疾病的终末阶段，病死率极高［11］。我国中草药资源丰富，种类繁多，从中草药的有效成分中探寻并开发对抗心力衰竭药物意义重大。近年来有研究［12-13］报道：QSYQ 在治疗心力衰竭、改善心脏功能、提高运动耐量及抑制炎症反应等方面具有良好效果。本研究采用冠状动脉前降支结扎法建立大鼠CHF 模型，并给予QSYQ 治疗心肌损伤，应用超声检测各组大鼠心功能，结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠LVSD 和LVDD 明显升高，而EF 和FS 明显降低，提示CHF 模型构建成功；与模型组比较，高剂量QSYQ 组大鼠LVSD 和LVDD 明显降低，EF 和FS 明显升高，表明QSYQ可明显改善CHF 模型大鼠心脏功能。

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内氧自由基产生过多，清除能力降低，导致氧化系统和抗氧化系统失衡，从而引起的氧化损伤过程。氧自由基可改变心脏结构而造成心脏功能异常，参与心力衰竭的演变进程。近年来研究［14］表明：心力衰竭动物模型中氧自由基明显增多，抵抗被氧化的能力降低。当氧自由基抵抗物质活性降低或产生过度时，将导致氧自由基沉积，进而刺激细胞膜脂质发生过氧化反应［15］。本研究结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠血清中LDH 活性及MDA 和ROS 水平明显升高，SOD 活性降低，机体内的氧化与抗氧化平衡被打破，产生氧化应激损伤；与模型组比较，高剂量QSYQ 组大鼠血清中LDH活性及MDA和ROS水平明显降低，SOD活性升高，表明QSYQ 可以通过降低CHF 模型大鼠机体内的氧化应激水平，缓解氧化损伤。

氧化应激可导致心肌细胞结构破坏和功能异常，进而导致心肌细胞凋亡增加，从而引起心功能损害，发生心力衰竭。细胞凋亡的发生由细胞凋亡蛋白调控，Bcl-2 家族蛋白在细胞凋亡过程中起着重要作用，Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平与凋亡调控直接相关。在外界刺激或Caspase-3 等因子活化时，Bax 从胞浆转入线粒体或细胞核膜，导致促凋亡因子与抗凋亡因子失衡，诱导细胞凋亡［16-17］。本研究采用TUNEL 染色观察各组大鼠心肌组织细胞凋亡情况，结果显示：假手术组大鼠心肌组织TUNEL染色切片中棕黄色细胞不明显，细胞凋亡率低，模型组大鼠心肌组织中棕黄色细胞明显增多，细胞凋亡率明显升高，高剂量QSYQ 组大鼠心肌组织中棕黄色细胞明显减少，细胞凋亡率明显降低；Western blotting 实验检测结果显示：QSYQ 能明显降低CHF 大鼠心肌组织中促凋亡蛋白Bax 和Cleaved-Caspase-3 的表达水平，同时上调Bcl-2 蛋白的表达水平，起到抗心肌细胞凋亡作用。

Nrf2/HO-1 信号通路是迄今发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路之一，机体内多种抗氧化酶都含有一个共同的启动子序列——抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE），在与ARE结合的多种转录因子中，Nrf2 是目前被认为起关键作用且可被外界因素诱导的，当发生氧化应激或受到其他化学物质刺激时，Nrf2 通过磷酸化与Keap1解耦连，激活Nrf2 进入细胞核，与ARE 特异性位点结合，进而诱导其下游表达一系列内源性的保护基因［18］。HO-1 为Nrf2 重要的下游靶基因，且为一种新型的心肌保护因子［19-20］。本研究结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显降低；与模型组比较，阳性药对照组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平差异无统计学意义，可能与卡托普利的作用机制有关，其可以通过扩张血管而控制血压，减轻心脏负荷来阻滞CHF 的进行性心室扩张［21］。而高剂量QSYQ 组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显升高，表明QSYQ 可能通过激活Nrf2/HO-1 信号通路，来发挥对CHF 模型大鼠心肌组织的保护作用。

综上所述，QSYQ 可能通过激活Nrf2/HO-1 信号通路抑制CHF 模型大鼠心肌组织的氧化损伤，发挥其对心肌细胞损伤的保护作用。本研究揭示了QSYQ 潜在的心肌保护作用机制，为其相关药物的开发和临床应用提供了实验依据。