吡柔比星对大鼠心肌细胞的损伤作用及其模型建立

李琪,徐瑞,李藤藤,江一川,李敏,

（1.吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室，吉林 长春 130021；2.锦州医科大学附属第三医院病理科，辽宁 锦州 120001；3.吉林大学药学院药理实验中心，吉林 长春 130021）

蒽环类药物是多种实体肿瘤和血液淋巴系统恶性肿瘤的基础性治疗药物。临床研究［1-2］显示：蒽环类药物可诱导心脏毒性发生，且常呈进展性和不可逆性。由于蒽环类药物导致的心脏毒性反应发生的复杂性和临床表现的多样性，目前尚无有效的治疗方法。近年来，抗肿瘤药物心脏毒性的研究成为热点，蒽环类药物导致的心脏毒性模型和心肌细胞损伤模型也逐渐在相关的研究中被广泛使用。其中，阿霉素（doxorubicin，DOX）诱导为目前国内外实验研究中常用制备心肌细胞损伤模型的方法，但其细胞死亡率较高［3-5］，干预手段常不能明显缓解心肌细胞的损伤。DOX 作为第1 代蒽环类药物，因其抗肿瘤针对性弱、心脏毒性大，临床上已逐渐被第3 代蒽环类药物吡柔比星（theprubicin，THP）等所取代。目前THP 在临床中广泛应用，但在接受THP 化疗的患者依然会出现不同程度的心脏毒性反应，限制其长期使用。深入研究蒽环类药物导致的心肌细胞损伤，寻找恰当的预防蒽环类药物导致的心脏毒性反应的手段仍然是肿瘤和心血管疾病研究的热点。由于DOX 诱导心肌细胞损伤的模型存在诸多缺陷，根据临床上蒽环类药物的实际应用情况，建立THP 诱导心肌细胞损伤模型具有现实意义。因此，本研究采用THP 作为造模药物，对比分析不同时间、不同浓度THP 诱导大鼠心肌细胞（H9C2 细胞）的损伤情况，探讨THP 诱导心肌细胞损伤模型的建立条件，为今后开展蒽环类药物心脏毒性的相关研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药品、主要试剂和仪器大鼠H9C2细胞由吉林大学生命科学学院实验室馈赠，吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室冻存。注射用THP（深圳万乐药业有限公司），DMEM 高糖培养液（美国Hyclone 公司），CCK-8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），DCFH-DA 活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（上海祤圣生物科技有限公司），丙二醛（malonaldehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（北京索莱宝公司），乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），TUNEL试剂盒（瑞士罗氏公司），TRIzol 试剂盒（美国Invitrogen 公司），逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），总蛋白提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。倒置荧光显微镜和生物显微镜（日本Nikon 公司），酶联免疫检测仪（美国MD 公司），实时荧光定量PCR仪（德国耶拿公司），电泳槽、流式细胞仪、CO2恒温培养箱和JJ260 型精密电子天平（美国BD 公司）。

1.2 细胞培养H9C2细胞生长于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的恒温密闭培养箱中进行常规培养并传代，0.25%胰蛋白酶消化，每2～3 d 消化传代1 次。

1.3 CCK-8 法检测各组细胞存活率在DMEM中制备浓度分别为1×10－6、1×10－5、1×10－4和1×10－3mol·L－1的THP工作液。将细胞接种于96 孔细胞培养板（每孔5×104个细胞），分别培养12、24、36 和48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，37℃孵育2 h。酶标仪检测450 nm 波长处吸光度（A）值。细胞存活率=实验组A 值/对照组A 值×100%。根据结果选择THP 最佳造模浓度（1～10 μmol·L－1）和时间（24 h），随后采用不同浓度THP（1、3、5、7 和9 μmol·L－1）处理细胞24 h，加入10 μL CCK-8，37℃孵育2 h，再次检测各组细胞存活率。

1.4 光学显微镜观察各组细胞形态表现将细胞接种于6 孔细胞培养板（每孔1×106个细胞）中培养24 h。细胞分为空白对照组和不同浓度THP 组，分别采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP 处理24h后，将6孔细胞培养板放入倒置显微镜下观察细胞形态表现，并拍照记录。

1.5 DCFH-DA ROS 试剂盒检测各组细胞中ROS水平使用DCFH-DAROS 检测试剂盒测定各组细胞中ROS 水平。将细胞接种于6 孔细胞培养板（每孔1×106个细胞）中培养24 h。细胞分为空白对照组和不同浓度THP 组，分别采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP 处理24 h。吸除弃液，用无血清DMEM清洗2次，加入1mL DCFH-DA（10 μmol·L－1），37℃孵育30 min，置于荧光显微镜下观察拍照。

1.6 各组细胞中MDA 水平及SOD 和LDH 活性检测将细胞接种于6 孔细胞培养板（每孔1×106个细胞）中培养24 h。细胞分为空白对照组和不同浓度THP 组，分别采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP处理24 h，收集各组细胞，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.7 TUNEL 试剂盒检测H9C2 细胞凋亡率将高压灭菌多聚赖氨酸处理过的盖玻片放入6 孔细胞培养板中，细胞分组同“1.6”，将细胞接种于6 孔细胞培养板（每孔1×106个细胞）中培养24 h。4%多聚甲醛中固定25 min，按照TUNEL 试剂盒说明书进行操作。应用荧光显微镜观察凋亡细胞，任选1 个视野进行凋亡细胞计数，计算H9C2 细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/全部细胞×100%。

1.8 qRT-PCR 法检测各组细胞中B 淋巴细胞瘤2相关X 蛋白（Bax）、B 淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和半胱氨酸蛋白酶9（Caspase-9）mRNA 水平将细胞接种于6 孔细胞培养板（每孔1×106个细胞）中培养24h。细胞分组同“1.6”，采用THP（1、5 和9 μmol·L－1）处理各组细胞24 h。收集细胞，TRIzol 法提取细胞中的总RNA，实验步骤参照试剂盒说明书。应用紫外分光光度计检测RNA 的浓度及纯度，反转录合成cDNA，步骤参照cDNA 合成试剂盒，根据qRT-PCR 试剂盒检测Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表达水平，内参基因为GAPDH。反应程序：94℃、15 s（变性）；58℃、15 s（退火），72℃、15 s（延伸），40 个循环。采用相对定量2－△△Ct法计算各组细胞目的基因mRNA表达水平。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequences of qRT-PCR primers

1.9 Western blotting 法检测各组细胞中凋亡相关蛋白表达水平将细胞接种于6 孔细胞培养板（每孔1×106个细胞）中培养24 h。细胞分组和处理见“1.6”。收集细胞，按照总蛋白提取试剂盒说明书提取各组总蛋白，采用BCA 定量，进行SDSPAGE 凝胶电泳，湿转法转膜至PVDF 膜上，Western blotting 法封闭液封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜，次日加入用Western blotting 法二抗稀释液稀释后的二抗，并在室温摇床孵育2 h，按照高敏感度化学发光检测试剂盒说明书滴加发光工作液显色后，以 GAPDH 为内参，采用 Image proplus 6.0 软件进行灰度分析。实验过程中涉及的抗体及稀释浓度见表2。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.10 统计学分析采用SPSS 23.0 统计软件进行统计学分析。各组H9C2 细胞存活率，细胞凋亡率，各组细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9 mRNA 表达水平和Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9 蛋白表达水平均符合正态分布且方差齐，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

表2 Western blotting 法检测中使用的抗体和稀释浓度比例Tab.2 Antibodies and dilutions used in Western blotting method detection

2 结果

2.1 CCK-8 法检测各组细胞存活率及倒置显微镜下H9C2 细胞形态表现CCK-8 法检测THP 细胞存活率，结果显示：THP 最佳造模时间为24 h，见图1A；造模浓度范围为1×10－6～1×10－5mol·L－1，见图1A 和B。与空白对照组比较，1、3、5、7 和9 μmol·L－1THP 组细胞存活率均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），各组细胞存活率见图1C。倒置显微镜观察结果显示：THP 处理后的细胞形态变小、数量减少，甚至死亡漂浮，见图2。根据以上结果，选择1、5 和9 μmol·L－1THP 组进行后续实验。

图1 各组H9C2 细胞的存活率Fig.1 Survival rates of H9C2 cells in various groups

图2 各组H9C2 细胞形态表现（×40）Fig.2 Morphology of H9C2 cells in various groups（×40）

2.2 各组H9C2 细胞中ROS 和MDA水平及SOD 和LDH 活性DCFH-DA 探针法检测细胞中ROS 水平，结果显示：与空白对照组比较，1、5 和9 μmol·L－1THP 组细胞中ROS 水平升高，且呈浓度依赖性。5μmol·L－1THP组细胞形态正常；9 μmol·L－1THP 组细胞变圆，见图3。与空白对照组比较，1 μmol·L－1THP 组细胞中MDA 水平和SOD 活性差异无统计学意义（P＞0.05），5 和9 μmol·L－1THP 组细胞中MDA 水平明显升高（P＜0.01），SOD 活性明显降低（P＜0.01），1、5 和9 μmol·L－1THP 组LDH 活性明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见图4。

图4 各组细胞中MDA 水平及SOD 和LDH 活性Fig.4 Intracellular MDA levels and SOD and LDH activities in various groups

2.3 各组H9C2 细胞凋亡率1、5 和9 μmol·L－1THP 组的细胞凋亡率分别为（7.01±3.03）%、（42.09±4.98）%和（92.21±3.08）%，较空白对照组（1.05%±0.94%）明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见图5。

2.4 各组细胞中 Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA表达水平与空白对照组比较，1、5 和9 μmol·L－1THP 组细胞中Bax和Caspase-3 mRNA表达水平明显升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05），1 μmol·L－1

THP 组Caspase-9 mRNA 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），5 和9 μmol·L－1THP 组Caspase-9 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01）。见表3。

2.5 各组细胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3 和Cleaved caspase-9 蛋白表达水平与空白对照组比较，1、5 和9 μmol·L－1THP 组细胞中Bax、Cleaved Caspase-3 和Cleaved Caspase-9 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图6。

表3 qRT-PCR 法检测各组H9C2 细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表达水平Tab.3 Expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in H9C2 cells in various groups determined by qRTPCR method(n＝3，）

表3 qRT-PCR 法检测各组H9C2 细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表达水平Tab.3 Expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in H9C2 cells in various groups determined by qRTPCR method(n＝3，）

*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol blank group.

3 讨论

图6 Western blotting 法检测各组H9C2 细胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3 和Cleaved Caspase-9 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.6 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expression levels of Bax，Bcl-2，Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 proteins in H9C2 cells in various groups determined by Western blotting method

蒽环类药物引起的心脏毒性具有累积性和剂量依赖性。2011 年中国临床肿瘤学会（CSCO）专家共识［6］指出：给予蒽环类药物6 年后超过50%的患者可发生左心室组织和功能亚临床心脏超声变化。氧化应激是目前公认的蒽环类药物引起心脏损伤的机制［7］。蒽环类药物易聚集于心肌细胞的线粒体中，其醌基结构在代谢过程中可循环生成许多ROS，促使心肌细胞发生凋亡和坏死［8-12］。此外，蒽环类药物还可以螯合铁离子后触发氧自由基的生成，引起心肌细胞膜脂质过氧化和心肌线粒体DNA 损伤［13-15］。另外，钙蓄积、心肌细胞凋亡的触发、神经调节蛋白生长因子1（neuregulin-1，NRG-1）/ErbB 信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号通路、β 肾上腺素受体（β-adrenergic receptor，βAR）和Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）等也参与蒽环类药物相关心脏毒性发病机制［16］。

目前，蒽环类药物心脏毒性的预防和治疗尚缺乏令人满意的方法，是国内外的肿瘤心脏病学研究领域一个亟需解决的问题。以DOX 制作实验性心肌损伤的细胞和动物模型为目前研究心脏毒性常用的途径与手段，这些模型制备方式因具有操作简单和费用低等特点而逐渐在基础研究中得到推广和应用［17］。但以DOX 诱导细胞和实验动物心肌损伤模型会出现较高的死亡率，DOX 诱导心肌损伤大鼠的死亡率高达30% 以上，给研究造成了极大困扰［18］。并且，由于DOX 的不良反应较为严重，临床上已经不再使用DOX 作为肿瘤患者的一线化疗药物。因此，寻找一种诱导成功率高、细胞和动物实验的死亡率低且与临床上实际用药相结合的制备心肌损伤模型的方式为目前关注的重点。本研究采用的造模药物为THP，是一种蒽环类药物，其所致心脏毒性等不良反应少于其他蒽环类药物，在临床中应用较为广泛，具有较实际的研究价值。

本研究采用CCK-8 法筛选出THP 制备H9C2损伤模型的作用最佳时间（24 h）和浓度范围（1～10 μmol·L－1）。当THP 浓度为1 μmol·L－1时，细胞的形态学改变，细胞中MDA 水平，SOD 和LDH 活性，细胞凋亡率，细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表达水平及Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 蛋白表达水平变化不明显，提示THP 浓度在低于1 μmol·L－1时引起H9C2 损伤程度过低，达不到实验造模要求；随着给药浓度的升高，当THP浓度为9 μmol·L－1时，细胞损伤程度过重，细胞变形严重，全部凋亡甚至死亡，提示THP 浓度过高也会对H9C2 损伤模型制备造成影响，不符合实验造模要求。而THP 浓度为5 μmol·L－1时，细胞形态趋于正常并未发生严重变形，细胞中ROS 水平升高，细胞凋亡率为40%，各项指标也符合实验要求，若增加保护心肌细胞损伤的药物或方法等有益干预，能够达到改善H9C2 造模后的损伤程度，可视为造模成功［19］。根据各实验组细胞形态学指标和细胞中MDA 水平、SOD 和LDH 活性、细胞凋亡率、细胞内凋亡相关因子mRNA 和蛋白表达水平等实验指标最终确定5 μmol·L－1THP 作为大鼠心肌细胞H9C2 损伤模型的最佳造模药物浓度。

综上所述，本研究所确定的造模药物浓度和时间仅针对研究中所提及的细胞系和培养条件，但对其他类似的实验条件也具有参考价值。在选取心肌细胞损伤模型时，还需要根据实验室条件，模型药物试剂的安全性、可重复性、有效性以及细胞凋亡时间、细胞活力和实验细胞检测指标的时间等综合考虑，尽量避免模型中试剂所引起的干扰，根据实际情况，选择合适的实验模型。