日本黄姑鱼鱼皮免疫活性肽的酶解制备工艺研究

董晓泽，徐书敏，王丽君，赵 越，王世光，唐云平，余方苗，丁国芳

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心，浙江舟山 316022）

免疫系统是人体的重要系统之一，它能有效的防止病菌入侵，维持机体健康[1-2]。免疫系统功能低下会降低人对疾病的抵抗能力，造成容易感染、生病等。巨噬细胞是研究免疫调节常用的细胞种类之一，它在免疫系统中扮演十分重要的角色，它可以激活其它免疫细胞，并且有噬菌作用。因此，研究药物对巨噬细胞增殖的影响十分重要。

生物活性肽（bioactive Peptides，BAP）是指对机体具有积极效果的肽类化合物。研究显示，生物活性肽具有降低血压血脂、抗菌以及免疫调节等作用[3-4]。目前广泛应用的生物活性肽的制备方法主要有三种：化学溶剂萃取、微生物工程发酵和酶促水解。用内肽酶和外肽酶水解生物蛋白来获得生物活性肽的方法被称为酶水解法[5-6]，酶水解提取法反应条件温和、安全无毒，因此成为食品及医药品行业的首选方法。不同的蛋白酶酶解同种蛋白的酶解产物的功能性质不同，蛋白酶的选择是采用酶解法制备生物活性肽的关键[7-9]。叶盛旺等[10]从青蛤中酶解提取的青蛤多肽具有激活巨噬细胞增强机体免疫力的作用；刘倩茹等[11]通过酶解法从北太平洋鱿鱼缠卵腺中提取了具有抗氧化活性的寡肽。宋茹等[12]利用中性蛋白酶从鱿鱼中提取了鱿鱼蛋白抗氧化肽。由此可见，酶水解法在提取生物活性肽领域中应用广泛。

日本黄姑鱼Nibea japonica 俗称黑毛鲿，主要分布于我国的东南部海和日本海南部区域[13-14]。目前的报道中对日本黄姑鱼的研究多集中于养殖与运输方面，关于日本黄姑鱼鱼皮免疫活性肽的研究报道较少，柴学军等[15]研究了盐度和温度对日本黄姑鱼胚胎发育的影响；孙敏等[16]研究了在发育早期的日本黄姑鱼体内消化酶的活性；孙鹏等[17]研究了运输胁迫对日本黄姑鱼肝脏抗氧化能力的影响。然而，在食品加工过程中（如制作鱼丸） 会产生许多副产品，如鱼皮、鱼骨等，这些物料可用作免疫活性肽的提取原料。YU Fangmiao，et al[18]研究了日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白的提取方法与溶解性；TANG Yunping，et al[19]研究了日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白在化妆品中应用的可能性。因此，本实验采用酶促水解法，以小鼠巨噬细胞RAW 264.7 的相对增殖率为评价指标进行最优酶种筛选，再经单因素实验和响应面分析法确定日本黄姑鱼鱼皮酶解工艺，以期为制备日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白肽和进一步研究其免疫活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

日本黄姑鱼：由浙江省海洋水产研究所提供。蛋白酶：北京亚太恒信生物科技有限公司。Dulbecco’s Modified Eagle Medium （DMEM）高糖培养基：Gibco 公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲亚砜（DMSO）：Sigma 公司。其余试剂均为国产分析纯。小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7：于中科院上海细胞所购买，由本实验室传代培养。

超纯水仪：美国Millipore 公司；高速低温离心机：日本日立公司；冷冻干燥机：德国CHRIST 公司；超净工作台：上海智诚分析仪器制造公司；CO2培养箱：美国Thermo 公司；倒置显微镜：日本OLYMPUS 公司；酶标仪：美国Bio-Rad 公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 日本黄姑鱼鱼皮免疫调节肽制备流程

日本黄姑鱼→取鱼皮→异丙醇脱脂→NaOH 去除杂蛋白→酶解→冷冻干燥→日本黄姑鱼鱼皮免疫调节肽。

1.2.2 日本黄姑鱼鱼皮预处理

将500 g 鱼皮用自来水清洗干净，剪成1 cm×2 cm 大小，异丙醇5 000 mL 脱脂24 h，用纯水将鱼皮洗至无异丙醇味；0.1 mol·L-1NaOH 溶液5 000 mL 去除杂蛋白24 h，用纯水洗至中性，将鱼皮放置于-20 ℃冰箱冷冻备用。

1.2.3 最优酶种的选择

称量5 g 日本黄姑鱼鱼皮，按最适pH 和温度[20]分别将胃蛋白酶（pH 2.0，37 ℃）、木瓜蛋白酶（pH 6.0，60 ℃）、中性蛋白酶（pH 7.0，45℃）、胰蛋白酶（pH 8.0，37 ℃）、碱性蛋白酶（pH 10.0，45 ℃） 5 种蛋白酶进行酶解反应。所用蛋白酶的量均为1 500 U·g-1、液料比（纯水与鱼皮的比例）10：1（mL·g-1），时间为6 h。采用MTT 比色法[21]检测各酶制备的产物对巨噬细胞RAW 264.7 增殖的影响，按照式（1）计算巨噬细胞RAW 264.7 相对增殖率，并以其为指标，筛选最优酶种。

实验组OD490为给药后的细胞上清液吸光度；空白对照组OD490为相同时间未给药的细胞上清液吸光度。

1.2.4 单因素实验

称量5 g 日本黄姑鱼鱼皮，使用1.2.3 中最优酶种，选取pH、温度、时间、加酶量、液料比5 个影响酶解过程的主要因素进行单因素实验，单因素水平表见表1。以巨噬细胞RAW 264.7 相对增殖率为评价指标，考察各因素对酶解产物活性的影响。

表1 单因素水平表Tab.1 Factor and levels

1.2.5 响应面实验

在1.2.4 单因素实验的基础上，用软件Design Expert V8.0.6 建立响应面实验，探求日本黄姑鱼鱼皮酶解最佳工艺。以巨噬细胞RAW 264.7 相对增殖率（Y/%）为考察指标，酶解温度（A），酶解时间（B）及液料比（C）为自变量，响应面实验因素水平编码见表2。

表2 响应面实验因素水平表Tab.2 Factor and Levels in response surface experiment

1.2.6 细胞培养

参照叶盛旺等[20]巨噬细胞RAW 264.7 的培养方法培养细胞并传代，选择对数生长期的细胞用于实验。

2 结果与分析

2.1 5 种蛋白酶酶解结果

由图1 得知，5 种商业蛋白酶中，中性蛋白酶制备的酶解产物作用下的RAW 264.7 细胞相对增殖率最高（41.53%）。因此选择中性蛋白酶为最优酶种。

2.2 中性蛋白酶酶解单因素实验结果

2.2.1 pH 单因素实验结果

由图2 得知，在pH 5～9 之间，酶解产物作用下的RAW 264.7 细胞相对增殖率的变化不大，pH 为7 时达到最大值（46.84%），可能由于酶的活性会随着pH 的改变而改变，最终导致酶解产物活性的改变。最终选定酶解pH 为7。

图1 5 种酶解产物对RAW 264.7 细胞相对增殖率的影响Fig.1 Effects of five enzymatic hydrolysates on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

图2 pH 对RAW 264.7 细胞相对增殖率的影响Fig.2 Effect of pH on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.2.2 温度单因素实验结果

由图3 得知，在35～45 ℃，酶解产物作用下的RAW 264.7 细胞相对增殖率显著提高，45 ℃时达到最大值（44.40%），之后，随着温度的增长，相对增殖率明显下降。最终选定酶解温度42.5～47.5 ℃进行响应面实验。

2.2.3 时间单因素实验结果

由图4 得知，在2～6 h 之间，酶解产物作用下的RAW 264.7 细胞相对增殖率显著提高，6 h 时达到最大值（47.19%），之后，随着时间的增长，相对增殖率减小。最终选定酶解时间5～7 h 进行响应面实验。

图3 温度对RAW 264.7 细胞相对增殖率的影响Fig.3 Effect of temperature on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

图4 时间对RAW 264.7 细胞相对增殖率的影响Fig.4 Effect of time on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.2.4 加酶量单因素实验结果

由图5 得知，在加酶量为1 500 U·g-1时，酶解产物作用下的RAW 264.7 细胞相对增殖率达到最大值（53.86%），之后，随着加酶量的增长，相对增殖率减小。最终选定酶解时的加酶量为1 500 U·g-1。

2.2.5 液料比单因素实验结果

由图6 得知，在液料比为10：1 （mL·g-1）时，酶解产物作用下的RAW 264.7 细胞相对增殖率达到最大值（49.38%），之后，随着液料比的增长，相对增殖率减小。最终选定液料比9：1～11：1 （mL·g-1）进行响应面实验。

图5 加酶量对RAW 264.7 细胞相对增殖率的影响Fig.5 Effect of enzyme amount on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

图6 液料比对RAW 264.7 细胞相对增殖率的影响Fig.6 Effect of liquid/solid ratio on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.3 中性蛋白酶响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计与结果及方差分析

根据单因素实验结果，选取酶解时间、温度及液料比3 个因素进行响应面实验，设计及结果如表3 所示。

表3 响应面实验设计与结果Tab.3 Respond surface experimental design and results

回归模型方程：Y=14.77-9.08A+0.76B-3.39C-8.95AB-2.26AC-10.03BC+31.41A2-16.20B2+17.95C2

该模型的回归方程的方差分析结果如表4 所示。拟合模型的F 值为16.28，对应P＜0.01，表明所得模型较显著。且该模型中误差失拟项P＞0.05，模型失拟不显著，表明该拟合方程与实验的拟合度较高，比较可靠。应用该回归模型能够对交互因素制备的日本黄姑鱼鱼皮酶解物对RAW264.7 细胞的相对增殖率进行分析和预测。

表4 模型回归方程方差分析Tab.4 ANOVA of regression equation

该模型的各交互因素的F 值被用于评价其对于实验评价指标的影响程度，更大的F 值说明该因素对RAW264.7 细胞的相对增殖率影响越大。由表4 可知，F（A）=62.34，F（B）=0.13，F（C）=8.44，即各因素对相对增殖率的影响顺序为时间＞液料比＞温度。

2.3.2 交互作用影响结果

响应面曲面的倾斜程度表示该因素对相对增殖率影响的强度；响应曲面倾斜程度越弱，说明其越可容忍该因素的影响[22]。等高线图中曲线形状表示2 个变量间的交互作用程度，越是趋近于椭圆形，交互程度越高，趋近于圆形则交互程度越低[23]。

由图7a、b 得知，在所考察的酶解温度和液料比范围内，相对增殖率有先增大后减小的趋势，且有极大值；相对增殖率随时间的增大而增大。另外，由等高线图可知，时间等高线更陡峭。由此可以推测时间对相对增殖率的影响大于液料比和温度。由图7c 得知，在液料比和温度等高线中，等高线沿液料比轴变化的趋势明显高于温度轴，说明液料比对相对增殖率的影响较温度大。

图7 响应面和等高线图Fig.7 Responsive surfaces and contour plot

2.3.3 最佳提取条件及验证

由Design-Expert V8.0.6 软件分析得最佳酶解工艺是：提取时间5.52 h，温度45.27 ℃，液料比为9.82：1（mL·g-1）。考虑到实际应用过程中操作方便，将工艺条件修正为提取时间5.5 h，温度45.5 ℃，液料比为10：1（mL·g-1）进行验证性实验。此条件下的理论提取率为57.80%。通过3 次平行试验，测得最佳条件下相对增殖率为57.47%，相对误差为0.57%，与理论提取率无显著性差异。表明应用响应面法模拟的模型及最佳条件可靠。

3 结论

本实验得到中性蛋白酶的最佳酶解条件是pH 为7，温度45.5 ℃，时间5.5 h，加酶量1 500 U·g-1，液料比10：1 （mL·g-1），在此工艺下所得日本黄姑鱼鱼皮酶解产物刺激RAW 264.7 的相对增殖率为57.47%。该工艺为制备日本黄姑鱼鱼皮酶解多肽的及进一步研究其免疫调节活性提供了依据。