菲律宾蛤仔共附生细菌Pseudoalteromonas sp.JP 多糖絮凝剂的分离纯化及表征

蒋广宁，崔 霞，穆 军

（浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

微生物絮凝剂解决了无机絮凝剂和高分子絮凝剂在污水处理、食品等方面用量大、二次污染等问题，它还有脱色、吸附重金属等优异性能[1-3]。因此引起人们对絮凝活性物质的研究兴趣。微生物胞外絮凝物质主要为多糖、蛋白质、核酸等[4-5]，而胞外多糖被认为是絮凝活性的主要物质。

海洋微生物物种和代谢产物活性复杂多样，有着巨大的研究价值和潜在用途。因此，海洋微生物的物种分析鉴定、代谢产物活性研究成为人们研究的重点方向。关于菌株筛选鉴定的报道很多，但对其活性物质的提纯、活性测定的研究还远远不足，为了对海洋微生物的物种资源进行保护，合理开发利用海洋微生物资源，海洋菌株的物种鉴定和分类将发挥着重要的作用。同时，对菌株发酵液中胞外多糖的提取纯化、采用高岭土实验测定其絮凝活性，促进微生物胞外代谢物在水处理方面的应用，这将对微生物絮凝剂的发展有重要意义。

本文从实验室前期筛选出的絮凝活性菌株中选取菌株Pseudoalteromonas sp.JP，对该菌株进行发酵培养，从其发酵液中提取分离多糖物质，红外光谱分析了此多糖的主要官能团，并对其絮凝活性和脱色活性进行测定。目前，这是首次对该菌株胞外多糖纯品的提取和红外光谱分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

絮凝活性菌株Pseudoalteromonas sp.JP：实验室前期筛选鉴定所得。

葡萄糖、尿素、酵母膏、硫酸铵、溴化钾、琼脂、蛋白胨、高岭土、氯化钠、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸钠、浓硫酸、浓盐酸、苯酚、无水乙醇等均为国产分析纯。

主要仪器：生化培养箱（LRH-系列，上海一恒科技有限公司）；恒温培养摇床（THZ，上海一恒科技有限公司）；冷冻离心机（Multifuge 1R，塞默飞世尔科技有限公司）；恒温定时搅拌器（JB-3A，上海雷磁仪器仪表有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A，上海一恒科学仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（Agilent Cary 60，美国安捷伦公司）。

1.2 培养基

海水培养基：K2HPO4（5 g·L-1）；KH2PO4（2 g·L-1）；CO（NH2）2（0.5 g·L-1）；（NH4）2SO4（0.2 g·L-1）；酵母膏Yeast extract（0.5 g·L-1）；葡萄糖（20 g·L-1）；1 L 人工海水（ASW），培养基初始pH 为7.5。在115 ℃下灭菌30 min。

人工海水配方：NaCl 23.926，Na2SO44.008，KCl 0.677，NaHCO30.196，KBr 0.098，H3BO30.026，NaF 0.003，MgCl2溶液53.27 mL （1.0 mol·L-1），CaCl2溶液10.33 mL （1.0 mol·L-1），SrO2溶液0.9 mL （0.1 mol·L-1）.

1.3 菌株来源

菌株Pseudoalteromonas sp.JP 来源于实验室的前期筛选鉴定，通过16SrDNA 测序和基因比对，鉴定其为水蛹交替假单胞菌Pseudoalteromonas undina，于2016 年8 月29 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12914。

1.4 絮凝菌株的接种培养及多糖的提取

使用海水培养基，将培养基装于4 L 的发酵罐中，在115 ℃条件下高压灭菌30 min，等待发酵罐冷却至室温，在无菌室中接种JP 菌株，并在28 ℃、180 r·min-1恒温培养48 h，灭菌前使用亚硫酸盐调节溶氧量，用pH 电极归零电位，发酵开始时，调节溶氧量和pH 为正常培养状态。

收集菌株发酵液并高速离心以除去菌体和残余代谢物。上清液过滤后浓缩，透析袋（2 000 da）去除小分子物质和残余的营养盐，在4 ℃下透析24 h，每8 h 换水1 次，浓缩透析液，缓慢加入3 倍体积的无水乙醇，混匀将混合物在4 ℃冰箱中放置过夜。离心收集混合液下层的白色絮状沉淀，冷冻干燥后即为多糖粗提物。

将多糖粗品溶液和Sevage 试剂（氯仿：正丁醇v：v=5：1）以相同比例混合，摇匀后静置30 min，去掉下层和蛋白层，除去蛋白。将得到的去蛋白多糖溶液浓缩，等待下一步的柱层析纯化。配制0.5 mg·mL-1的脱蛋白多糖溶液，在紫外可见分光光度计下进行波长扫描，以检查蛋白是否除去以及是否有存在核酸。

1.5 分离纯化

柱层析纯化方法采用文献[7]中的方法并稍作修改。将粗多糖溶液（3 mL）上样于DEAE 纤维素层析柱（2.5 cm×30 cm），依次用去离子水、0.1、0.3、0.5 mol·L-1的NaCl 溶液洗脱，流速为1.0 mL·min-1，自动部分收集器收集洗脱液（5 min/管），同时用硫酸苯酚法[8]检测各管的多糖含量，并绘制洗脱液吸光曲线，合并洗脱液后浓缩、透析得到初步纯化的絮凝微生物胞外多糖溶液，将多糖样品溶于5 mL 去离子水中，加样于Sephadex G-100 凝胶层析柱（1.5 cm×50 cm），用去离子水洗脱，流速为0.2 mL·min-1，自动部分收集器分步收集流出液（10 min/管），用硫酸苯酚法[8]测定各管的糖含量，将吸光曲线在同一峰下的各管洗脱液合并、浓缩、冷冻干燥获得纯多糖。

1.6 絮凝活性测定

絮凝活性的测定参照GAO Qi，et al[9]的方法并稍作修改：测定培养液的絮凝活性（絮凝率用FR 表示）。新鲜配制的高岭土悬浮液（4 g·L-1）用磁力搅拌器高速搅拌1 h。向烧杯中加入93 mL 高岭土悬浊液，5 mL 1%（m/v） CaCl2溶液，之后加入2 mL 待测上清液。用2.0 mol·L-1氢氧化钠或2.0 mol·L-1盐酸溶液调节pH至7.5。快速搅拌絮凝混合液1 min（180 r·min-1）以混合均匀，再缓慢搅拌絮凝体系2 min（60 r·min-1），静置体系10 min，吸取絮凝混合液上层，用分光光度计于550 nm 波长下测量其吸光值，用2 mL 的去离子水做空白对照，且每个样品平行测定3 次，取平均值。絮凝活性计算公式为：

其中，A0：对照组在550 nm 处的吸光度；A：多糖样品在550 nm 处的吸光度。

1.7 脱色活性测定

脱色活性的测定使用文献[10]中的方法稍微修改，将脱色活性用脱色率（DC）表示。对3 种染料进行脱色实验，包括亚甲基蓝，结晶紫和孔雀石绿。移取1 mL 的原液（400 mg·mL-1、400 mg·mL-1、1 000 mg·mL-1），稀释至100 mL，用氢氧化钠溶液（80 g·L-1）调节体系pH 值7.5～8.0，加入样品溶液（1 mL），将混合物缓慢搅拌1 min 并静置1 h，以9 000 g 的转速离心10 min，在相同的条件下，分别测量3 种稀释溶液在660、580和620 nm 处的吸光度，并将去离子水用作参比。脱色活性计算如下：

其中DC 代表脱色率；A0和A 分别是对照和样品的吸光度值。剂量范围为50～300 μg，相应的反应浓度为0.5～3.0 mg·L-1。

1.8 红外光谱分析

将纯多糖（1 mg）与充分干燥的KBr 粉末（100 mg）混合均匀，将混合粉末在玛瑙研钵中撵细成均匀，用红外线照射烘干，并用压片机压成薄片。然后用红外光谱扫描仪BIO-RAD FTS3000 在4 000～400 cm-1的范围内扫描，扫描速率为1 cm-1。去除背景吸收后，可得到多糖样品的红外吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 扫描结果

粗多糖溶液经紫外扫描后，如图1 所示，在220 nm和280 nm 处无特征吸收，表明此多糖溶液蛋白质已去除干净，且不含有核酸。

图1 去除蛋白后的JP 粗多糖紫外扫描曲线（200～400 nm）Fig.1 UV scanning curve of JP crude polysaccharide after protein removal （200-400 nm）

2.2 柱层析纯化

如图2（A）所示，JP 菌株胞外多糖粗品进行阴离子交换柱层析后，在0.1 mg·L-1的NaCl 溶液梯度下，得到1 个多糖组分，将该多糖组分用凝胶渗透色谱Sephadex G100 进行柱层析，如图2（B），验证了其为单一多糖组分。收集该峰下的洗脱液组分，经过浓缩，冷冻干燥后获得多糖纯品。

图2 JP 菌株胞外粗多糖经过阴离子交换柱层析所得的洗脱曲线（A）；离子交换层析组分过凝胶渗透色谱得到的洗脱曲线（B）Fig.2 Elution curve of the extracellular crude polysaccharide of JP strain by anion exchange column chromatography （A）； Elution curve obtained by gel permeation chromatography of ion exchange chromatography component（B）

2.3 活性测定

不同剂量条件下测得JP 多糖纯品的絮凝活性，如图3 所示，在0.8 mg·L-1的JP 多糖剂量时，最佳絮凝效果达到83.5%，在反应剂量超过1.5 mg·L-1或小于0.2 mg·L-1时，絮凝效果几乎为零。同样，对多糖纯品关于3 种染色剂包括甲基蓝、结晶紫、孔雀石绿的脱色效果进行了探究。结果显示，多糖剂量对脱色活性的影响与絮凝活性相似，过多或较低剂量都会影响多糖的活性。多糖反应剂量为1.5 mg·L-1时，对孔雀石绿达到最佳脱色效果93.6%。絮凝反应剂量在0.5～1.0 mg·L-1之间，脱色反应剂量在1.5～3.0 mg·L-1之间，对于絮凝或脱色反应，对于多糖的剂量有着较高的要求，可见絮凝体系有着严格的反应比例。

图3 JP 多糖剂量对絮凝率的影响如图3A；JP 多糖剂量对脱色活性的影响如图3BFig.3 The effect of JP polysaccharide dosage on flocculation rate is shown in Fig.3A； the effect of JP polysaccharide dosage on decolorization activity is shown in Fig.3B

2.4 红外光谱分析

如图4 的多糖傅立叶红外光谱扫描（4 000～400 cm-1）中，在3 406 cm-1处的宽吸收峰为羟基伸缩振动吸收峰；2 927 cm-1是脂肪链烃C-H 伸缩振动吸收峰；1 647 cm-1处吸收峰是羧基的对称和反对称伸缩振动的特征峰；1 145 cm-1吸收峰是多糖衍生物中C-O-C 键的特征吸收；622 cm-1处吸收峰为C-H 面外振动峰。各吸收峰均为多糖的特征吸收，主要官能团包括羰基、羟基、亚甲基等典型官能团。微生物絮凝剂中羟基和羰基的存在可以改善生物絮凝剂的结合能力，吸附更多的杂质颗粒，促进絮凝效果的产生。

图4 JP 菌株胞外多糖的傅立叶红外光谱图Fig.4 The fourier infrared spectrum of extracellular polysaccharide of JP strain

3 结论

（1）利用离子交换柱deae，采用氯化钠梯度洗脱的方法和凝胶渗透色谱法去粗取精，获得JP 菌株胞外多糖纯品。

（2）对JP 菌株胞外多糖提取纯化，获得的纯多糖组分有着较好的絮凝活性和脱色效率，有望用于其他废水处理和微生物絮凝剂的开发。

（3）利用红外光谱对多糖进行官能团的鉴定，主要官能团有羰基、羟基、亚甲基等，其中羟基、羰基的存在可能对絮凝分子的吸附效果有促进作用，絮凝作用与吸附架桥机理类似。