电针对快速老化小鼠认知功能及海马CA1区锥体神经元树突结构的影响

史宝光,董蕾蕾,王奇,严辞

(1.沈阳医学院附属第二医院,沈阳 110002;2.杭州市第七人民医院,杭州 310013)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种进行性和不可逆性的神经退行性疾病,表现为记忆减退及认知功能障碍[1]。据报道,自 2010年以来全球约有3650万AD患者,且每年新增病例约770万人[2]。AD的发病机制目前尚未明了,可能与β淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白异常磷酸化、免疫炎症和氧化应激等有关[3]。近年来研究表明,树突萎缩和突触丢失与认知功能损害有关。Cochran JN等[4]在2014年首次提出AD的突触假说,认为AD患者存在神经轴突营养不良、树突复杂性降低和树突棘丢失。既往有研究显示,可溶性 Aβ可导致海马CA1区神经元树突结构、棘突密度和突触超微结构受损,导致AD早期认知功能障碍[5]。AD目前仍缺乏有效治疗手段,针灸可能为AD的治疗带来新的思路。本课题组在前期研究发现,电针百会、肾俞和太溪穴可以改善 SAMP8小鼠的认知功能,并抑制大脑额叶Aβ蛋白和胰岛素降解酶的表达[6]。为了进一步探讨电针在 AD治疗中的机制,本研究观察电针治疗后SAMP8小鼠海马CA1区锥体细胞树突的结构变化,并检测了突触可塑性相关蛋白的表达,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

16只7月龄SPF级SAMP8雄性小鼠和8只7月龄SPF级雄性正常老化SAMR1小鼠,体质量(25±5)g,均购于北京华阜生物科技有限公司(合同编号FKWDXs- 201600361)。动物在温度为20℃～25℃、湿度为(50±5)%、明暗周期为12 h/12 h的环境中饲养,允许自由摄食和饮水。

1.2 主要试剂与仪器

大鼠脑立体定位仪(89-00136,泰盟科技有限公司);电针治疗仪(G6805,上海医疗器械有限公司生产);针灸针(0.30 mm×25 mm,苏州医疗用品厂有限公司);Morris水迷宫视频跟踪系统(泰盟科技有限公司);振动切片机(KD-400,南北仪器设备有限公司);光学显微镜(CX31,奥林巴斯);戊巴比妥钠[F20120816,中国医药(集团)上海化学试剂公司];Golgi-Cox溶液(HTKNS1125NH,博蕾德生物科技有限公司);BCA试剂盒(SJH1001,睿信生物科技有限公司);兔抗PSD-95(GR208408-1,Abcam公司);兔抗BDNF(ab108383,Abcam公司);兔抗p-TrkB和兔抗TrkB(P106674、P62539,Bioworld公司);兔抗RhoA(015H1492,Invitrogen公司);兔抗ROCK2(BS3482,Bioworld公司);β-actin抗体(130592-20,信裕生物科技有限公司)。

1.3 分组及干预方法

采用随机数字表法将16只SAMP8雄性小鼠随机分为模型组和治疗组,每组 8只,另外 8只正常老化SAMR1小鼠作为对照组。对照组和模型组不做任何处理,治疗组小鼠接受为期8周的电针干预。参考《实验针灸学》[7]选取穴位,取百会(顶骨正中)、肾俞(第二腰椎下旁开5 mm之两旁肋间)、太溪穴(内踝后方的凹陷部位)作为针刺点。电针治疗仪治疗频率为2 Hz,电压2 V,电流0.6 mA,1次/d,15 min/次,连续治疗8周。

1.4 检测指标

1.4.1 小鼠认知功能

疗程结束后采用 Morris水迷宫实验检测所有小鼠的空间学习记忆能力。先定位导航实验,将小鼠放入水中自由游泳2 min,以适应环境。定位航行实验为期5 d,每天固定时间训练4次。训练开始时将平台置于其中1个象限,每个时间段将小鼠从水池壁4个起始点面向水池壁放入水池。记录小鼠每次2 min内寻找到平台的时间,即为逃避潜伏期(如果2 min内小鼠未寻找到平台,其潜伏期记录为2 min)。每天以4次潜伏期的平均值为小鼠当日学习成绩。空间探索实验,定位导航实验5 d后,于第6天撤除平台进行空间探索实验,将小鼠从某一固定象限放入水中,记录2 min内跨平台次数[8]。

1.4.2 小鼠海马CA1区锥体细胞树突超微结构

用 2%戊巴比妥钠(10 mL/kg)麻醉小鼠,开胸后经主动脉灌注生理盐水清洗小鼠体内血液,随后用 4%多聚甲醛溶液进行灌注。取小鼠完整脑组织,浸泡于Golgi-Cox溶液中,避光室温下放置2周。用切片机经海马区冠状连续切片(厚度为100 μm)。将切片浸泡于Golgi-Cox溶液中,随后用ddH2O漂洗。用梯度乙醇依次脱水,二甲苯透化,用中性树胶封片。光学显微镜下观察小鼠海马CA1区锥体神经元图像。神经元图像的选择标准为锥体神经元位于 CA1区内,细胞位置和整体形态清晰,胞体和分支颜色均匀一致,第三分支完整。用Image J软件对神经元进行重构并进行Sholl分析。以神经元胞体为中心,做间距为 20 μm的同心圆,分析树突与同心圆的交点数之和,以此反映树突分支[9]。

1.4.3 PSD95、BDNF、TrkB、RhoA和ROCK2蛋白表达检测

用 Western blot法检测突触后致密蛋白(Postsynaptic density protein 95, PSD95)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、酪氨酸激酶受体B(Tyrosine kinase receptor B, TrkB)、Ras同系物家族成员 A(Ras homolog family member A, RhoA)和Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶 2(rhoassociated coiled-coil containing protein kinase 2, ROCK2)蛋白表达。取小鼠海马CA1组织,加入蛋白裂解液,匀浆后4℃离心。用BCA试剂盒进行蛋白定量检测,随后进行SDS-PAGE凝胶电泳,将分离的蛋白电转至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭,加入一抗。兔抗 PSD-95(1:1000)、兔抗BDNF(1:400)、兔抗p-TrkB和兔抗TrkB(1:500)、兔抗 RhoA(1:800)、兔抗 ROCK2(1:800)、β-actin内参抗体(1:1000),4℃摇床过夜。TBST洗涤3次后加入羊抗兔二抗,温室下作用1 h,再用TBST洗涤3次,最后用ECL显影。应用Image J软件对结果进行图像分析,计算条带与β-actin的灰度比值。

1.5 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件进行数据处理分析。符合正态分布的数据用均数±标准差表示,组间比较用单因素方差分析,两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠认知功能

3组水迷宫训练第5天时逃避潜伏期和跨平台次数的组间比较差异有统计学意义(F=42.401,P＜0.001;F=7.128,P=0.004)。两两比较结果显示,与对照组比较,模型组逃避潜伏期明显延长(P＜0.001),而跨平台次数明显减少(P＜0.05);与模型组比较,治疗组逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05),而跨平台次数明显增加(P＜0.05)。详见图1。

图1 8周后3组小鼠逃避潜伏期和跨平台次数比较

2.2 海马CA1区锥体细胞树突的超微结构

采用 Golgi染色法观察海马 CA1区锥体细胞树突。3组基底和顶端树突长度及分支数目的组间比较差异有统计学意义(F=29.996,P＜0.001;F=14.799,P＜0.001;F=7.684,P=0.003;F=16.382,P＜0.001)。与对照组比较,模型组基底和顶端树突长度及分支数目明显减少(均P＜0.001);与模型组比较,治疗组基底和顶端树突长度及分支数目均明显增加(P＜0.001,P=0.001,P=0.005,P=0.028)。详见图2、图3。

图2 3组小鼠海马CA1区锥体神经元的形态(Golgi染色,×200)

图3 3组小鼠海马CA1区神经元基底树突和顶端树突长度和分支数目比较

2.3 PSD95、BDNF、TrkB、RhoA和ROCK2蛋白表达水平

与对照组比较,模型组PSD95、BDNF和TrkB蛋白表达水平明显下降(P＜0.05),而RhoA和ROCK2表达水平明显升高(P＜0.05)。电针治疗8周后,与模型组比较,治疗组PSD95、BDNF和TrkB蛋白表达水平明显升高(P＜0.05),而 RhoA和 ROCK2表达水平明显下降(P＜0.05)。详见图4、图5。

3 讨论

阿尔茨海默病(AD)是一个全球性健康问题,给家庭和社会带来沉重的负担。针灸疗法在AD治疗中的作用越来越受到关注[10]。本研究用SAMP8快速老化小鼠进行研究,这种小鼠是从普通的遗传群 AKR/J系小鼠中通过表型选择培育出的快速老化小鼠,表现为早期增龄性学习记忆缺陷,同时伴有 Aβ淀粉样蛋白沉积,是目前公认的用于研究AD的动物模型[11]。本研究发现,电针百会、肾俞、太溪穴,可以明显改善SAMP8快速老化小鼠的空间学习记忆能力,并增加海马 CA1区基底和顶端树突长度和分支数目。

中医学有记载称“脑为髓之海”以及“肾藏精、主骨生髓”,脑髓的产生及代谢依赖于肾气的不断滋养,故“肾脑相济”理论是AD发病的主要病理机制[12-13]。本研究采用的百会穴隶属于督脉,是足太阳膀胱经、手少阳三焦经、足少阳胆经、足厥阴肝经交汇之处,又称三阳五会,为联系脑部以及调节大脑功能的重要穴位[14]。肾俞穴隶属于足太阳膀胱经,主要治疗腰膝酸软、泌尿系统感染等。太溪穴是足少阴原穴,临床主治肾病、四肢厥冷,有滋阴益肾之功效。本课题组前期研究发现,电针百会、肾俞和太溪穴可以明显缩短SAMP8小鼠逃避潜伏期[4],与本研究结果一致,说明电针可以改善老年痴呆小鼠的认知功能。

图4 PSD95、BDNF和TrkB蛋白表达水平

图5 RhoA和ROCK2蛋白表达水平

树突是神经元胞体上伸出的短而多分支的突起,树突的分支上有树突棘,与其他神经元末梢形成突触。树突的形态决定了神经元的输入及处理,进而影响突触后输出的能力。树突在记忆和认知中有重要作用[15]。有研究发现,海马 CA1区神经元锥体细胞的功能改变与认知功能障碍密切相关[16]。本研究发现,SAMP8小鼠海马 CA1区锥体树突的长度和分支数均发生变化,与Šišková Z 等[17]和 Wang S 等[18]报道一致。Price 等用腹腔注射可溶性淀粉样蛋白β低聚物建立了AD小鼠模型,发现海马 CA1区顶端树突的长度和分支数降低,而基底树突未见明显变化,这与本研究结果有所差异,可能与小鼠品系有关。本研究发现,电针8周后,SAMP8小鼠海马CA1区基底和顶端树突长度和分支数目均明显增加,进一步证实了电针对认知功能的作用。

PSD95是突触后结构中的一种支架蛋白,对维持突触结构和可塑性非常重要,能够影响树突的形态和数量[19]。BDNF是神经营养素家族的重要成员,对调控神经分化和生长非常重要。BDNF可结合细胞表面TrkB受体,进而激活下游信号通路。BDNF/TrkB可参与活性依赖的突触可塑性调节,能够影响皮层和海马的树突数量和密度[20]。本研究发现,与正常老化小鼠比较,SAMP8快速老化小鼠海马PSD95、BDNF和TrkB蛋白表达水平明显下降。Li Y等[21]建立了Aβ25-35诱导的痴呆大鼠模型,发现海马BDNF蛋白表达水平明显下降,与本研究结果一致。Rho蛋白属于小G蛋白超家族的亚家族成员,在大脑神经元树突形态和突触可塑性中具有重要作用。β-淀粉样蛋白可以增加海马 RhoA水平,抑制神经突起生长;激活 RhoA可降低树突棘长度和密度[22]。既往研究证实,RhoA/ROCK2信号通路的激活与认知功能障碍有关[23]。本研究发现,SAMP8小鼠海马RhoA和ROCK2明显升高;经过8周的电针治疗后,小鼠海马PSD95、BDNF和TrkB蛋白表达水平明显升高,而RhoA和ROCK2表达水平明显下降。

综上所述,电针可以明显改善 SAMP8小鼠的认知功能,并增加海马 CA1区基底和顶端树突长度和分支数目。电针治疗后海马PSD95、BDNF和TrkB蛋白表达水平明显升高,而RhoA和ROCK2表达水平明显下降。上述结果提示,树突可能是电针治疗AD的靶点。未来需要进一步探讨电针治疗 AD的明确机制及持续作用时间。