寨卡病毒结构蛋白基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

张经伟，王 晗，刘 靖，马 乐，李 伟，步志高，华荣虹

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 150069）

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）属黄病毒科黄病毒属，经伊蚊传播，兔、猪和人对其易感[1]，是一种重要的人兽共患病病原。该病毒最早于1947年在乌干达寨卡森林中的恒河猴体内分离出来[2]。ZIKV病毒粒子呈球形，外有一层囊膜包裹，基因组为不分节段的单股正链RNA，长度约11 kb，从5'端开始编码C蛋白（核衣壳蛋白）、prM蛋白（囊膜蛋白）和E蛋白（囊膜糖蛋白）3种结构蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5 7种非结构蛋白[3]。目前，依据分子生物学和生物信息学可将其分为亚洲型和非洲型2种亚型[4]。

ZIKV感染宿主后能引起寨卡热。大多数感染者并没有明显症状或者症状较为轻微，包括发热、皮疹、结膜炎、肌肉和关节疼痛等症状，病程约2～7 d。但若在怀孕期间发生感染可能使出生胎儿患有小头症和其他先天性畸形，同时还可能造成早产或流产等严重症状[5-6]。

ZIKV在全球范围内呈蔓延趋势，目前，我国虽无相关重大疫情的报道，但其对于我国仍具有潜在威胁[7]。本研究对ZIKV C、prM和E基因进行克隆并构建原核表达载体，通过纯化蛋白并免疫新西兰大白兔成功制备抗ZIKV C、prM和E基因的多克隆抗体，为进一步研究该病毒的致病机制及建立ZIKV感染快速诊断方法奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料BHK-21细胞由本实验室保存；ZIKV由本实验室构建；DMEM、胎牛血清、Opti-MEM、胰酶和青链霉素混合液购自GIBCO公司；Triton X-100购自Sigma公司；Albumin Bovine V购自Biotopped公司；佐剂MONTANIDETM ISA 61 VG购自SEPPIC公司；FITC标记的山羊抗兔IgG购自中山金桥公司；鼠抗MBP单克隆抗体为本实验室制备。

1.2 ZIKV结构蛋白C、prM和E全长cDNA表达质粒的构建与鉴定根据GenBank公布的ZIKV（FSS13025株）基因编码序列，将C、prM和E基因的密码子针对大肠杆菌进行优化，合成并分别克隆至pMAL-c5x载体中，构建pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表达重组质粒。

1.3 重组质粒表达、鉴定与纯化将pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表达重组质粒分别转化至ER2523感受态细胞，经抗性筛选后挑取单个菌落于4 mL氨 抗性LB中，37℃摇床220×g培养12～16 h后，按1∶100接种于100 mL LB培养基至D600为0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG后继续震荡培养4 h。将诱导菌液离心经超声破碎后，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定蛋白表达情况。重组表达蛋白经MBP亲和层析柱纯化并鉴定后，置于-80℃保存。

1.4 ZIKV结构蛋白C、prM和E多克隆抗体的制备将重组蛋白与MONTANIDETM ISA 61 VG佐剂按重量比为6∶4比例充分乳化，进行免疫，首免时将佐剂与蛋白混匀并充分乳化后背部皮下注射新西兰大白兔，免疫剂量为300 μg/只。在3周和6周后分别进行二免和三免。三免7 d后心脏采血并分离血清。

1.5 多克隆抗体免疫反应性及效价检测将本实验室构建的ZIKV接种于BHK-21细胞，经72 h后收集细胞沉淀，SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜上，用5%脱脂乳室温封闭2 h，以制备的多抗（1∶200）作为一抗，以红外荧光标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000）进行Western blot检测。同时将BHK-21细胞感染ZIKV，置于37℃、5%CO2温箱中培养48 h后，用PBS洗涤1次，再用4%多聚甲醛室温固定细胞10 min，用PBS洗已固定细胞3次，每次5 min，用0.1% triton X-100作用10 min，PBS洗1次后加入稀释的兔血清，以FITC标记的山羊抗兔IgG（1∶200）为二抗进行IFA实验。

2 结果

2.1 表达ZIKV结构蛋白C，prM和E全长cDNA的构建与鉴定根据GenBank公布的ZIKV C、prM和E蛋白编码序列，对C、prM和E蛋白基因密码子进行优化后人工合成，将合成基因分别克隆至pMAL-c5x载体，经鉴定后成功构建pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表达重组质粒（图1）。

图1 pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E双酶切鉴定Fig.1 Identification of pMAL-c5x-ZIKV-C, pMAL-c5x-ZIKV-prM and pMAL-c5x-ZIKV-E by Not I and BamH I

2.2 重组蛋白表达、纯化与鉴定将pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E分别转化至ER2523感受态细胞，经IPTG诱导后，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定，分析蛋白表达情况。结果显示，pMAL-c5x-ZIKV-C（图2）、pMAL-c5x-ZIKV-prM（图3）和pMAL-c5x-ZIKV-E（图4）表达产物分别在55 kDa、60 kDa和100 kDa左右出现条带，与预期大小一致。

图2 SDS-PAGE(A、B)和Western blot(C)验证可溶性ZIKV-C蛋白表达与纯化Fig.2 Identification of expression and purification results of ZIKV-C by SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C)

图3 SDS-PAGE(A、B)和Western blot (C)验证可溶性ZIKV-prM蛋白表达与纯化Fig.3 Identification of expression and purification results of ZIKV-prM by SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C)

图4 SDS-PAGE(A、B)和Western blot(C)验证可溶性ZIKV-E蛋白表达与纯化Fig.4 Identification of expression and purification of ZIKV-E by SDS-PAGE(A, B) and Western blot (C)

2.3 多克隆抗体免疫反应性及效价检测利用3次免疫后获得的兔血清为一抗，红外荧光标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western blot，分别检测血清中多克隆抗体的特异性，结果在相对分子质量14 kDa、17 kDa和55 kDa处出现了特异性条带，与预期结果相符（图5）。IFA检测结果显示，所制备的3种血清抗体均能与ZIKV感染的细胞反应，产生亮绿色荧光信号，而阴性对照兔血清则无荧光信号产生（图6）。结果表明所制备的抗C蛋白、prM蛋白以及E蛋白血清均能与ZIKV特异性结合，可以用于间接免疫荧光试验分析。将各血清抗体进行梯度稀释检测结果表明，anti-C、anti-prM、anti-E血清抗体IFA的效价分别为1∶1600、1∶1600和1∶3200。

图5 Western blot鉴定结果Fig.5 The results of Western blot

3 讨论

ZIKV是一种重要的人兽共患病病原，成年人感染后一般无明显症状，少数人会出现如格林巴利综合征等严重症状[8-9]，怀孕期间ZIKV感染会导致新生儿出生缺陷如小头症等[10]。目前，我国虽无相关重大疫情的报道，但已有相关研究显示ZIKV对猪具有易感性[7]，对于我国养猪业具有潜在重大威胁。但是，由于目前尚无有效治疗办法，因此，预防ZIKV储备疫苗的研制迫在眉睫。

黄病毒属的病毒抗原结构基本类似，其结构蛋白决定免疫原性与细胞嗜性。然而，ZIKV在许多方面与其他黄病毒不同，例如，其可以通过体液传播，胎盘感染以及造成新生儿缺陷[11]。ZIKV C、M和E结构蛋白均可诱导机体产生抗体。衣壳蛋白（C）是一种多功能蛋白，其在核衣壳组装过程中与病毒RNA结合，通过与细胞蛋白相互作用，调节细胞代谢、细胞凋亡和免疫反应在病毒感染过程中发挥重要作用。膜蛋白（M）由prM蛋白前体经酶剪切而来且prM蛋白对于病毒成熟、出芽和分泌十分重要[12]。囊膜蛋白（E）参与病毒与受体结合，膜融合以及宿主免疫识别，其包括4个结构域：负责锚定胞膜的茎-跨膜结构域以组成蛋白质剩余主要β链表面部分的结构域Ⅰ（DomainⅠ，D Ⅰ）、Ⅱ和Ⅲ，DⅡ连接DⅠ和DⅢ[13]。DⅢ既是病毒与宿主细胞吸附的关键区域，也是最主要的抗原区域[14]。

多克隆抗体具有制备过程相对简单、成本低以及周期短的优点[15]，并且其可以识别相应抗原的多个抗原表位，增强靶蛋白信号，提高其检测灵敏度[16]。本研究通过优化密码子序列，同时利用大肠埃希菌表达目的基因蛋白产量大，培养条件相对简单和生长速度快等优点成功表达出ZIKV C、prM和E蛋白，经MBP柱纯化后制备相应抗原，免疫新西兰大白兔，IFA和Western blot结果显示成功制备了C、prM和E蛋白多克隆抗体，且具有良好的特异性，其中C蛋白多克隆抗体与ZIKV反应性较弱，经分析原因推测：①实验动物对象健康状况不佳；②产生大量非特异抗体致使其反应性太差；③由于抗原具有多个表位，存在交叉反应。

图6 IFA鉴定C、prM、E蛋白多克隆抗体与ZIKV的反应性Fig.6 Detection of ZIKV by IFA with polyclonal antibodies against C, prM and E protein, respectively

本研究制备的多克隆抗体不仅可用于M和E蛋白的结构和功能的研究，同时也为建立ZIKV感染快速诊断方法奠定了基础。