实时质谱新技术分析南极磷虾油的脂质组学轮廓

张燕平 王海星 陈 康 饶 伟 崔益玮 沈 清*

（1 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省麻醉重点实验室 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 浙江温州325000 3 沃特世科技（上海）有限公司 上海200120）

南极磷虾（Euphausia superba）是一类生活在南大洋中的甲壳类浮游动物，其具有生物蕴藏量大、分布广等特点，是重要的战略性海洋新资源。据估计，南极磷虾贮藏量有6.5～10 亿t 之巨，最大耐受捕捞量约为400～600 万t[1]。在世界海洋渔业资源日益衰减的背景下，日本、挪威等国家相继加入南极磷虾的科研与开发，并将磷虾油等相关产品产业化。南极磷虾中富含磷脂结合型n-3脂肪酸，比鱼油中的甘油三酯型n-3脂肪酸更易吸收，是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的有效来源[2]。试验表明，南极磷虾油具有降低胆固醇，预防老年痴呆症，预防动脉硬化，抗炎症，保护视力及改善大脑学习机能等生理功能[3]。目前针对南极磷虾脂质组学研究国内外尚未见报道，开展南极磷虾脂质组学研究，将深化南极磷虾脂质营养学的认识，促进以南极磷虾为原料的虾油开发。

脂质组学（Lipidomics）是继基因组学和蛋白质组学后又一迅速发展的热门领域，研究内容包括生物体内脂质分子结构鉴定与定量，以及其在生物代谢、疾病、免疫等所扮演的角色分析[4]。随着软电离离子化技术和高分辨质谱技术的发展及其在脂质分析中的应用，实现了快速、高精度的分析生物样品中各种微量脂质，极大地促进了脂质分析规模性、整体性的发展[5]。近几年来质谱技术的应用越来越广泛，研究人员也对质谱高通量快速检测技术提出了更高的要求。然而，生物组织样本无法直接用于高灵敏度的质谱检测，通常需要专业人员经组织均浆、化合物提取、分离纯化等复杂繁琐的样品前处理后，方能用于质谱分析，无法实现组织样本的实时质谱监测，亦无法满足高通量组学技术研究的需求[6-8]。

快速蒸发离子化质谱（Rapid evaporative ionization mass spectrometry，REIMS）是一种用于临床生物组织原位动态实时鉴定的新兴技术手段，以热电灼蚀生物组织物质为基础，诱导生物分子离子化，形成含有电粒子的气溶胶，经离子传输管道进入质谱仪分析[9]。2009年，Schafer等[10]在解吸电喷雾技术（Desorption electrospray ionization，DESI）及高频电刀装置耦联高分辨质谱仪的基础上研发了REIMS，为原位电离质谱和质谱代谢组学研究提供了一种全新的研究方法和研究思路。以REIMS 为基础的组织分析通常只需要几秒钟的时间即可完成数据采集与分析并实现组织识别，精确度达到90%～98%。目前，REIMS 已成功应用于临床组织切除，肿瘤诊断，微生物鉴定，食品鉴别等方面。

本研究基于REIMS 建立了高通量实时获取南极磷虾油脂质组学轮廓的方法，旨在高效、快速分析市场上南极磷虾油及相关功能性保健食品的脂类成分，为食品安全相关职能部门提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾，辽渔南极磷虾科技发展有限公司产品；甲醇、乙腈、异丙醇（均为色谱纯级），德国Meker 公司；甲酸（色谱纯级），美国Tedia 公司；亮氨酸脑啡肽，美国Sigma-Aldrich 公司；其它实验室常用试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

Xevo G2-XS 四极杆飞行时间质谱仪（配有快速蒸发离子源）、Masslynx 4.1 数据采集软件、LiveID 统计分析软件，美国Waters 公司；Pump11 elite 针泵注射进样器，美国Harvard 公司；Milliplus 2150 超纯水处理系统，美国Millipore 公司；其它均为实验室常用仪器和设备。

1.3 试验条件

1.3.1 南极磷虾油提取 将南极磷虾组织匀浆后冷冻干燥，精确称量5.0 g 样品于50 mL 离心管中，加入25 mL 95%乙醇振荡混匀，在恒温水浴锅中常温浸提2 h，混合物用冷冻离心机以9 000 r/min 条件离心10 min，用移液管转移上清液，向下层沉淀加入15 mL 95%乙醇重复萃取2 次，合并上清液；用旋转蒸发仪于65 ℃下将有机溶剂蒸干得到南极磷虾油浓缩液。

1.3.2 质谱检测 南极磷虾油样品通过加热探头（500 ℃）离子化，所形成的气溶胶由文丘里泵氮气（2 bar）驱动，采用正交方式经PTFE 管引入质谱，主要装置如图1所示。以丙二醇/亮氨酸脑啡肽混合物为辅助溶剂，经针泵注射进样器以0.1 mL/min 的流量引入端口，用于清洗杂质，提高信号强度，锁定质量校正。质谱接口内设铬铝钴耐热钢A1 灯丝（1.1 Ω，3 V，500 ℃）用于辅助碰撞电离，离子碰撞后进入质谱仪StepWaveTM装置；质谱仪扫描时间：1 s；扫描范围：m/z 50～1200；所有数据均以负电离模式收集。

图1 用于检测南极磷虾油脂质组学轮廓的REIMS 装置图Fig.1 The setup of REIMS for the acquisition of lipidomics profiling of Antarctic krill oil

1.4 统计分析

将原始质谱图经MassLynx 进行峰匹配、峰对齐及滤噪处理等，结果保存为文本格式。根据质谱数据得到主要质谱峰的质荷比，部分主峰碎片离子信息等，结合Lipid MS Predictor 和LipidMap数据库及文献报道确定或推测脂质的结构信息。

2 结果与讨论

2.1 南极磷虾油提取优化

脂质组学分析常采用的提取方法为Folch 法和Bligh & Dyer 法，然而这2种方法需要用到氯仿等毒性级别较高的有机试剂。考虑到南极磷虾油作为保健食品的安全性指标，本试验采用乙醇作为萃取媒介，从南极磷虾干粉中提取南极磷虾油。比较优化了不同体积分数的乙醇溶液对南极磷虾油提取率的影响。由图2可知，南极磷虾油的得率随着乙醇体积分数增加而提高，其中95%乙醇提取效果最佳，当使用纯乙醇时，得率有所下降。

2.2 REIMS 脂质组学轮廓分析

REIMS是一种无须任何样品前处理的实时质谱方法，通过将原样表面离子化，获得实时质谱轮廓图。使用LiveID等软件识别轮廓图并对特征离子峰降维、建模后，可实现对未知样品的实时鉴定与准确度评分。由于REIMS 未与高效液相色谱等分离技术联用，故目前REIMS 相关研究主要以定性为主，其在化合物精确定量方面尚未有所建树。因此，本试验研究焦点主要在于获得南极磷虾油的脂质组学轮廓图，对各个脂质分子的绝对含量不做具体讨论。

REIMS 常用的离子源为单极电极，通过在给定电流下切割组织，使组织表面的小分子快速蒸发并离子化，通过离子传输管路进入质谱端口。由于南极磷虾油为液态样品，无法使用单极电极切割模式，故本试验采用电热探头的方式使南极磷虾油受热快速蒸发，脂类化合物离子化并随气溶胶一并进入质谱质量分析器。使用电热探头轻触南极磷虾油表面，质谱扫描范围设定在m/z 0～1 200，通过MassLynx 记录质谱数据。由图3可知，南极磷虾脂质分子离子峰主要出现在m/z 200～900 区域范围内，并由2 个明显的峰簇组成，即m/z 200～500 范围内的脂肪酸离子峰簇和m/z 600～900 范围内的磷脂离子峰簇。从相对含量来看，脂肪酸离子峰的信号响应显著强于磷脂离子峰的信号强度，前者的峰面积约为后者的7.6 倍。脂肪酸离子的来源一部分是南极磷虾油中的游离脂肪酸电离生成，另一部分是甘油酯、磷脂及胆固醇酯等脂类受电热探头高能裂解，其脂肪酸链碎片化电离后反映在质谱图中。

图2 乙醇体积分数对南极磷虾油提取得率的影响Fig.2 The effects of ethanol volume fraction on the extraction yield of Antarctic krill oil

图3 南极磷虾油REIMS 全扫描质谱图Fig.3 The REIMS spectrum of Antarctic krill oil

图4 南极磷虾油脂肪酸脂质组学轮廓谱Fig.4 The lipidomics profiling of Antarctic krill oil

图4a 为南极磷虾油脂质组学轮廓图m/z 在200～500 区域内的脂肪酸离子峰，各个峰分离度较好，信噪比较高几乎看不到基质峰；通过对其鉴定和积分，得到脂肪酸结构和相对含量如表1所示。信号响应强度最大的为m/z 301，相对含量达到了21.59%，经鉴定其结构中碳原子数和双键比为FA 20：5，即所熟知的EPA。其次分别为m/z 327（FA 22：6，DHA，14.44%），m/z 281（FA 18：1，12.62%），以及m/z 255（FA 16：0，18.74%）。南极磷虾油中检出疑似FA 18：4 的脂肪酸离子峰m/z 275（3.78%），该组分通常在植物性油料作物中检出。同时，m/z 391，m/z 417等疑似为超长链脂肪酸FA 26：2（6.17%），FA 28：3（2.10%），其存在可能与南极磷虾受极寒环境胁迫，促使其代谢产生长链脂肪酸以提高体液流动性相关；相关假设尚需进一步验证。

图4b 为m/z 400～900 范围内的磷脂离子峰，由于磷脂的信号响应显著低于脂肪酸，基质效应相对较强，经降噪和峰提取后，共鉴定出26种磷脂分子，包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂腺肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）。其中信号最强的离子峰为m/z 763（11.67%），其结构疑似为[PG 36：7-H]－；其次是m/z 737（11.46%），结构[PC O-38：3-choline]－/[PE O-38：3-NH3]－。相同碳原子数和双键比下，PC 丢失胆碱碎片后的分子结构与PE 脱氨基结构相同，因此在REIMS脂质组学轮廓谱中无法区分。以质谱峰m/z 695.4为例，经鉴定其sn1/sn2脂肪酸链的总碳原子和双链数量为34：3，其分子结构组成可能为[PCcholine]-，或[PE-NH3]-，亦或是两者的重叠。南极磷虾油中PI 分子较少，仅有m/z 835（[PI 34：1-H]－，1.79%）和m/z 843（[PI O-36：4-H]－，1.47%）检出。

2.3 方法学验证

有机溶剂燃点较低，通过电热探头离子化易发生明火，目前尚未构建标准定量溶剂体系。因此，方法学验证中的灵敏度测试采用倍数稀释法，通过向南极磷虾油中添加预先脱胶的大豆油稀释后进行REIMS 检测。结果显示，南极磷虾油稀释4倍后26种磷脂分子依然能快速检出，谱图经降噪后与图4b 相近，除信号强度降低以外脂质组学轮廓特征相似，未有显著差异。南极磷虾油稀释10倍后检出的磷脂分子数减少为14种，各个磷脂离子峰的信号强度等比例下降，部分轮廓特征丢失。精确度测试采用日内精密度和日间精密度评价。脂肪酸和磷脂各选取2 个离子m/z 301，m/z 327，m/z 763 和m/z 737，分别于同一日连续测定7 次和连续测定5 d，计算得到其日内精密度RSD≤6.24%，日间精密度RSD≤8.57%。方法学验证结果显示，该方法能满足南极磷虾油中脂肪酸和磷脂的脂质组学轮廓分析测试要求。

3 结论

采用REIMS 技术将南极磷虾油中的脂质直接离子化并获得实时脂质组学轮廓。在负离子模式下南极磷虾油受电热探头激发成离子态，并随气溶胶引入质谱端口，经质量分析器检测共有20种脂肪酸和26种磷脂分子被检出，其中EPA（m/z 301，21.59%）和DHA（m/z 327，14.44%）为质谱图中主要离子峰。该方法能快速、高效进行南极磷虾油脂质组学轮廓实时检测，相关数据能为质谱工作者提供理论基础，为海洋功能食品企业和部门提供相关依据和参考。

表1 南极磷虾油中脂肪酸相对含量与结构分析Table 1 The relative content and probable attribution of fatty acids in Antarctic krill oil

表2 南极磷虾油中磷脂相对含量及结构分析Table 2 The relative content and probable attribution of phospholipids in Antarctic krill oil