发酵乳中抗性淀粉的变化及对凝胶过程的影响

王绍帆 黄 欢 何 君 韩育梅

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010018）

将马铃薯抗性淀粉添加于发酵乳中，一方面可以在非淀粉源的食品中发挥抗性淀粉在人体肠道内的益生作用；另一方面可以发挥糖类大分子的作用，对发酵乳的品质产生影响。现阶段有关马铃薯抗性淀粉在发酵乳中的研究还不够深入。本文选用RS2型玉米抗性淀粉（G）和微波-湿热法制备的RS3型马铃薯抗性淀粉（W），研究它们在发酵乳加工、贮藏过程中含量和形态的变化，探讨抗性淀粉在发酵乳中的作用机理，为深入研究糖类大分子与蛋白质分子的相互作用以及实际生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微波-湿热法制备的马铃薯抗性淀粉（纯度≥90%），实验室自制；RS2型玉米抗性淀粉（高直链玉米淀粉，纯度≥90%），国民淀粉；全脂乳粉，恒天然公司；YF-L812 型发酵乳发酵剂和Bb-12 双歧杆菌，科汉森；葡萄糖检测试剂盒，贝博生物；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MCR-3E 常压微波合成萃取仪，郑州世纪双科实验仪器有限公司；SX-500 蒸汽灭菌器，TOMY公司；Rheolaser Master 型光学法微流变分析仪、TLAB AGS 型Turbiscan 稳定性分析仪，Formulaction 公司；Phenom Pro 扫描电子显微镜，Phenom-Word 公司；BK3200 型光学显微镜，重庆光电仪器有限公司；T6 新世纪型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。

1.3 试验条件

1.3.1 样品的制备 按照国标GB 19302-2010[3]，根据工艺“牛奶→标准化→加入添加剂→均质→加热杀菌→冷却→加入发酵剂与益生菌→恒温发酵→搅拌冷却→后熟→保藏”制备发酵乳。添加剂分别为1.5%的高直链玉米淀粉（G）和微波-湿热法制备的马铃薯抗性淀粉（W）。发酵剂选用丹麦科汉森YF-L812 型号发酵剂（含德氏乳杆菌保加利亚亚种与嗜热链球菌），益生菌为丹麦科汉森双歧杆菌BB-12。发酵结束后，将其在4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 抗性淀粉含量的变化 参考Coni[4]的方法作适当修改，乳液与抗性淀粉混匀加热、均质、95℃处理5 min、发酵2 h、发酵结束以及贮藏期1，3，7，14，21 d，取上述各阶段的抗性淀粉添加量为质量分数1.5%的发酵乳样品，折算样品中抗性淀粉的含量。

1.3.3 抗性淀粉结构的变化 参考孙慢慢[5]的方法，制备含有质量分数1.5%抗性淀粉的发酵乳，选取乳液与抗性淀粉混匀加热后、均质后、95 ℃处理5 min 后、发酵2 h 后、发酵结束后以及贮藏期1，7，14，21 d 为取样测定时间点，在光学显微镜400 倍下观察，并采集图像。

1.3.4 抗性淀粉对发酵乳凝胶形成微观结构的影响 参考Cui等[6]与Bakirci等[7]的方法，将贮藏1 d 含有质量分数1.5%抗性淀粉的发酵乳样品在10 kV 电压和5 000 倍扫描电子显微镜下观察，并采集图像。

1.3.5 抗性淀粉对发酵乳凝胶形成过程的微流变分析 参考Titapiccolo等[8]的方法，利用光学微流变仪监测含有质量分数1.5%抗性淀粉的发酵乳发酵期与贮藏1 d 凝胶体系的稳定性。

1.3.6 抗性淀粉对发酵乳凝胶体系的稳定性分析参考白洁等[9]和吕长鑫等[10]的研究，使用稳定性分析仪，采用850 nm 近红外光源的监测探头检测发酵乳发酵期与贮藏1 d 凝胶体系的稳定性。

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1.4 数据分析与处理

稳定性数据采用Turbiscan 型稳定分析仪自带的Turbiscan Easysoft 软件进行数据分析；微流变数据采用Rheolaser Master 型光学法微流变分析仪自带的Smart 软件进行数据分析。利用Orgin 9.4 绘制图表。

2 结果与分析

2.1 发酵乳加工、贮藏过程中抗性淀粉残留量的变化

含抗性淀粉发酵乳的功能性一方面反映了发酵乳自身的益生作用，另一方面体现在乳中所含抗性淀粉的功能性。因此研究抗性淀粉在发酵乳加工、贮藏过程中含量的变化，不仅有助于综合评价其功能性，而且可进一步研究抗性淀粉在发酵乳中的存在形式和作用方式。

图1 抗性淀粉的残留量Fig.1 Residual quantity of resistant starches

由图1可见，这2种抗性淀粉在发酵乳加工、贮藏过程中的含量整体呈现下降趋势，且下降的程度不同。在P=0.05 的显著水平下，Ducan 检验发现，G 与W 的残留量差异明显，其中G 残留量维持在50%左右，W 的残留量较高且稳定在60%以上。此外，发酵乳加工、贮藏过程中不同的阶段对抗性淀粉的残留量有显著差异（P＜0.05），在P=0.05 的显著水平下，经Ducan 检验发现，发酵乳在前3 个阶段抗性淀粉残留量变化不显著，说明物理加工过程以及发酵前期对于抗性淀粉影响不大。在发酵期结束后，抗性淀粉的含量有明显降低，可能是发酵后期乳酸菌大量产酸且体系中积累了大量的酸[11]，进而影响了抗性淀粉的含量。在发酵乳加工、贮藏全过程中，抗性淀粉约有40%的损失，且多集中于贮藏期。由此可得，添加W是最好的选择。

2.2 发酵乳加工、贮藏过程中抗性淀粉形态的变化

如图2所示，混匀后发酵乳中淀粉颗粒形态完整，均质对其形态无明显改变，可能是由于淀粉颗粒有一定的刚性结构且粒径较小，经高温杀菌处理后W 颗粒边缘轮廓变得模糊，其处于一种相对膨胀的状态；而G 无明显变化，可能是由于G颗粒较小导致其膨胀松散的形态不易被观察到。发酵开始后，由于蛋白质凝胶网状结构的形成，淀粉的背景结构呈现出不均一的云雾状，且随着贮藏时间变长颜色也逐步加深，可推测抗性淀粉颗粒一定程度上分散在发酵乳的凝胶网状结构里。贮藏期2种样品中均能发现较为完整的淀粉颗粒，这与抗性淀粉的残留量所反映结果一致，验证在含有抗性淀粉的发酵乳加工贮藏全过程中有一定量且结构完整的抗性淀粉存在。

图2 抗性淀粉的颗粒形态Fig.2 Granular shape of resistant starch

2.3 抗性淀粉对发酵乳凝胶形成微观结构的影响

由图3可见，与空白组相比，含抗性淀粉的发酵乳微观结构明显不同，含W 的发酵乳微观结构几乎没有空洞，并且酪蛋白胶粒更加致密，而含G的发酵乳微观结构疏松，且酪蛋白胶粒之间有大量空隙。含W 的发酵乳凝胶结构更为完整且较为均匀，其电镜图片的左上角处还发现有不同于蛋白质凝胶网状结构的规则块状物，同样在含G 发酵乳电镜图片的右下角也出现了表面光滑的椭球状物，推测分别是W 与G 的淀粉颗粒。而W 的淀粉颗粒不同于G，镶嵌在发酵乳的凝胶网状结构中，边缘与酪蛋白存在一定的融合与接触。就微观结构而言，W 更有助于发酵乳形成完整均一的微观结构。

图3 发酵乳微观结构扫描电镜图Fig.3 Scanning electron micrograph of the fermented milk microstructure

2.4 抗性淀粉对发酵乳凝胶形成过程微流变学参数的影响

发酵乳的加工过程包括发酵和后熟，凝胶结构形成于发酵阶段，而在后熟期其凝胶结构也会受到温度和后酸化的影响。如图4、图5、图6所示，所有样品的EI，MVI 和SLB 变化趋势大体相同。EI 在0～2.5 h 的发酵时间内基本保持水平，此时酪蛋白还没有形成网状的凝胶结构，同时MVI和SLB 处于较大程度的波动状态。含有G 发酵乳的MVI 较高，而含有W 发酵乳的MVI 较低，可能是由于随着乳液中微生物的产酸，原来水包油型结构被破坏，原有的蛋白胶体开始解离，且菌体生长繁殖也导致乳液中微粒大小变化[12]。W 对应的SLB 最大且大于空白组偏向于液体性质，G 使发酵乳相对于空白组在0～2.5 h 发酵时间内更接近于固体性质。发酵时间在2.5 h 左右，所有样品的EI，MVI 以及SLB 均出现拐点，此时凝胶形成也称为凝胶点，且各样品达到凝胶点的时间较为接近，说明与空白对照相比抗性淀粉对发酵乳凝胶的速率影响不大。凝胶点后，主要是酪蛋白完成解离并开始聚集形成凝胶结构，所有样品的EI 和MVI快速上升至峰值。此时发酵乳中EI 大小的顺序是W>K>G，而各个样品的MVI 较为接近。这与所有样品的SLB 出现谷值表现一致，因为凝胶结构使样品更多地显现固体性质，也说明体系中胶体微粒移动受到酪蛋白聚集的影响[13]。然后所有样品的EI 开始缓慢降低并趋于平缓，同时SLB 逐渐上升后趋于平缓，而MVI 则出现一个谷值后上升，可能由于微生物继续产酸而导致一部分在酪蛋白胶束内部和之间的胶体磷酸钙溶解，使得凝胶结构弱化[14]。随着pH 不断接近酪蛋白的等电点，酪蛋白颗粒间静电排斥减少且疏水性的相互作用增强，更多蛋白簇相互链接进而形成最终的凝胶结构[14]。发酵结束时，含有抗性淀粉发酵乳的SLB 在0.5 附近且低于空白组的SLB 值，EI 与MVI 均大于空白组，且含W 发酵乳的EI 与MVI 大于含G的发酵乳，因此含有抗性淀粉的发酵乳具有相对坚固固体结构的特性，相比G，W 能够强化凝胶结构。后熟期结束后空白组的SLB 仍高于其它样品组，因此含抗性淀粉的发酵乳相比空白组更趋向固体性质。空白组的EI 最低，其次为含G 的发酵乳，W 在后熟阶段EI 有一定升高，说明其凝胶网状结构变得更为紧密，与扫描电镜观察发酵乳的微观结构表现一致，可能与W 颗粒影响网状结构的收缩有关。各样品的MVI 后熟过程中出现不同程度的下降，空白组的MVI 最低，其次为含G 的发酵乳，W 使发酵乳有较高的MVI。

图4 发酵乳的EIFig.4 Elastic index of fermented milk during the fermentation

图5 发酵乳的MVIFig.5 Viscosity index of fermented milk during the fermentation

图6 发酵乳的SLBFig.6 Solid Liquid Balance of fermented milk during the fermentation

微观分析发酵乳从发酵到后熟的过程发现，W 相对于G 和空白组使发酵乳有着更坚固的结构，同时也增加了黏度。因此，添加W 的发酵乳使得酪蛋白凝胶网状结构结合得比较紧密，从而限制了大分子微粒的自由移动，同时出现较低的SLB 也可验证其有更好的固体结构性质[12]。此外，2种抗性淀粉在发酵乳凝胶形成的过程中对凝胶的积极影响作用也存在差异性，W 更加有助于酪蛋白颗粒结合形成更加坚固的结构。

2.5 抗性淀粉对发酵乳凝胶体系稳定性的影响

图7 反应各发酵乳样品在发酵及后熟期对应样品高度的背散射光强相对于发酵起始阶段的变化情况。背光参比值变大代表样品所在高度的环境中微粒吸收光强值变大，表明颗粒变大，反之则代表吸收光强值变小而颗粒变小；参比值变化越大说明体系越不稳定，图像中正峰与负峰分别表示微粒出现较大程度的聚集或者分离，类似沉淀或澄清[15]。

图7（空白）中样品的背光散射图反映了空白组发酵乳加工过程中稳定性的变化。通过背光散射比值与时间的变化关系发现，所有样品均出现不同程度的顶部澄清现象，这可能与酸化和冷冻导致凝胶网状结构收缩引起持水力下降有关[16]。含有W 的发酵乳样品中间部位散射光比值变化程度较大，说明相对于空白样而言，含有W 的发酵乳形成的凝胶网络结构中蛋白质类的大分子物质结构的变化更大，验证了抗性淀粉使发酵乳凝胶网状结构更为紧密，同时在一定程度上也会对蛋白质的粒径产生影响[17]。含有G 的发酵乳中，中间段的光强变化较为均匀且平行变化的程度大于空白组，说明含G 酸乳中酪蛋白胶粒聚集程度较大，而在发酵乳的顶端，出现了较大幅度的澄清和聚集现象，乳清析出与脂肪上浮的情况较严重。图8 反映的是各个样品稳定性动力学指数，表示样品稳定性随时间的变化，其数值越大表明稳定性越差[10]。因此，含W 发酵乳的微观稳定性优于含G的发酵乳。

图7 不同发酵乳样品的背散射光光强值Fig.7 Back scattering light intensity values of different fermented milk samplese

3 结论

本试验研究表明，在发酵乳加工贮藏过程中，W 相对于G 残留量较高且维持在60%左右；2种抗性淀粉均保留着淀粉颗粒形态，但有不同程度的损耗，主要集中在发酵后期与贮藏期；W 更有助于发酵乳形成完整均一的微观结构；含有W 的发酵乳微观弹性较强且有助于酪蛋白颗粒结合形成更加坚固的结构；含W 发酵乳的微观稳定性优于含G 的发酵乳。与空白对照相比，在发酵乳中添加W可提升发酵乳的品质以及潜在的益生功能性。

马铃薯抗性淀粉对发酵乳的影响效果存在由其理化性质导致的差异，推测作用方式为：作为填充物，增加凝胶网状结构中蛋白质粒子的密度，增强发酵乳的黏度和稳定性；在发酵期凝胶形成过程中，影响酪蛋白分子的解离与聚集，增加凝胶强度与结构稳定性；影响乳酸菌的代谢，自身含量也受到乳酸菌代谢的影响，还可以保护发酵乳中的益生菌，同时结合自身含量可提升发酵乳的益生功能性。对于抗性淀粉在发酵乳加工贮藏过程中损失机理的研究，还可结合微生物代谢途径以及抗性淀粉在对应环境中的稳定性变化进行深入探讨，从而有助于相关产品的市场推广和公众保健意识宣传。

图8 不同发酵乳样品的稳定性动力学参数Fig.8 Stability kinetic index of different fermented milk samples